部分落葉松屬植物重復(fù)序列及分子核型的研究.pdf

1、落葉松屬(Larix)是松科(Pinaceae)中較進(jìn)化且分布廣泛的一個(gè)屬，對(duì)該屬進(jìn)行基因組組成和結(jié)構(gòu)分析，對(duì)于研究松科乃至整個(gè)裸子植物類(lèi)群的基因組進(jìn)化和物種系統(tǒng)發(fā)育具有重要的意義。迄今為止，對(duì)落葉松屬的細(xì)胞學(xué)研究仍停留在早期的常規(guī)核型分析和簡(jiǎn)單的染色體熒光分帶水平，分子細(xì)胞遺傳學(xué)方向的研究相對(duì)貧乏。本文以多種不同的基因組重復(fù)序列為切入點(diǎn)，對(duì)落葉松屬的興安落葉松(Larix gmelinii)、華北落葉松(L. principis-ru

2、pprechtii)、日本落葉松(L．kaempferi)和長(zhǎng)白落葉松(L .olgensis)的基因組組構(gòu)特點(diǎn)及精細(xì)核型結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。包括45S和5S核糖體RNA基因及落葉松屬染色體DAPI帶紋區(qū)域特異序列LPD串聯(lián)重復(fù)序列的染色體物理定位，端粒序列和高拷貝DNA重復(fù)序列的分離和鑒定，以及最后將以上各種重復(fù)序列作為探針，應(yīng)用多色熒光原位雜交技術(shù)，對(duì)這4種落葉松體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行了綜合熒光標(biāo)記，構(gòu)建了落葉松屬植物的分子核型。具體研究

3、結(jié)果歸納為以下三個(gè)部分： 1．應(yīng)用不對(duì)稱PCR分析的方法，以包含5個(gè)重復(fù)單元的擬南芥型端粒重復(fù)序列(TITAGGG)5和(CCCTAAA)<,5>分別為單引物，從興安落葉松基因組中進(jìn)行擴(kuò)增，分離并克隆了若干單一片段，對(duì)其中的4個(gè)克隆LTA14、LTB2、LTB15和LTB28進(jìn)行了多方面的鑒定。核酸分子組成和Southem雜交分析表明，這4個(gè)克隆均含有一定比例的擬南芥型端粒重復(fù)序列和其簡(jiǎn)并序列，并廣泛存在于整個(gè)落葉松基因組中；核

4、酸序列中AT含量為58.8％～63.4％。FISH定位分析顯示，LTA14和LTB2在整個(gè)基因組中具有較弱的彌散信號(hào)，在所有染色體端部呈現(xiàn)雙點(diǎn)狀信號(hào)，在染色體臂間部具特異性條帶信號(hào)；LTB15均勻地彌散存在于整個(gè)基因組；LTB28僅在染色體末端具較弱的雙點(diǎn)狀信號(hào)。以上結(jié)果說(shuō)明落葉松屬的染色體端粒部位的DNA序列很可能仍主要由擬南芥型TRS組成，但含量較低，可能在進(jìn)化過(guò)程中，大部分重復(fù)單元發(fā)生了變異或退化。 2．發(fā)展了PCR分析與

5、分子雜交分析相結(jié)合分離高拷貝重復(fù)序列的策略，從日本落葉松基因組中，首先以十堿基寡核苷酸引物進(jìn)行隨機(jī)PCR擴(kuò)增，得到206條不同的擴(kuò)增片段；應(yīng)用相繼進(jìn)行的斑點(diǎn)雜交、Southern雜交和克隆策略對(duì)這些片段進(jìn)行篩選，最終得到6個(gè)含有高拷貝重復(fù)序列的克隆LRA82.1、LRA82.2、LRA98、LRA129、LRA241.3和LRA427。將這6個(gè)克隆在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)同源序列，但其中的LRA82．1、LRA82．2、

6、LRA98間存在300bp～400 bp的同源區(qū)段。SolJthern雜交分析顯示，6個(gè)LRA克隆均為彌散型重復(fù)序列片段，并保守地存在于落葉松屬各個(gè)種中，但不同種間的拷貝數(shù)略有差異。FISH定位結(jié)果顯示，6個(gè)克隆均存在彌散分布信號(hào)，其中LRA241-3均勻分布于整個(gè)基因組；LRA82．1、LRA82.2、LRA98在染色體組中的若干區(qū)域存在缺失，這些區(qū)域?yàn)镾C和部分染色體著絲粒；LRA129和LRA427則在染色體特定區(qū)域存在擴(kuò)增而呈現(xiàn)

7、出較強(qiáng)的條帶模式信號(hào)。 3．常規(guī)核型分析顯示，落葉松屬不同種之間具有保守的二型核型，包括一組由12條中部著絲粒染色體組成的長(zhǎng)染色體群和一組由12條近中部著絲?；蚪瞬恐z粒染色體組成的中長(zhǎng)染色體群，核型公式可以統(tǒng)一為2n=2x=12m+ 10sm+2sm (2st)。以25S和5S rDNA、LPD序列、端粒序列克隆LTA14和彌散型重復(fù)序列克隆LRA427等5種探針，分組混合后，分兩次與相同的細(xì)胞進(jìn)行多色熒光原位雜交。各種探針

8、在不同染色體上產(chǎn)生了不同排列組合的標(biāo)記模式，使幾乎全部的染色體可以被區(qū)分。在此過(guò)程中，本研究首次將組和標(biāo)記探針?lè)椒☉?yīng)用于植物分子核型構(gòu)建和裸子植物的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。以興安落葉松為參照，設(shè)定了統(tǒng)一的落葉松屬分子核型標(biāo)準(zhǔn)模式，將不同落葉松的染色體分為12組，同組內(nèi)染色體視為同源或部分同源染色體。在這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，我們可以最終確定以上各種重復(fù)序列在落葉松中的染色體定位，其中，45S rDNA位點(diǎn)分別位于3號(hào)、4號(hào)和8號(hào)(日本落葉松除外)染色體

9、的SC，5S rDNA位于3號(hào)染色體短臂近端部區(qū)域；4個(gè)種的10號(hào)染色體不具LPD序列位點(diǎn)，而興安落葉松和華北落葉松中的11號(hào)染色體則具不穩(wěn)定LPD序列位點(diǎn)；LRA427克隆則分別在1號(hào)、7號(hào)、8號(hào)(日本落葉松特有)、10號(hào)、11號(hào)(興安落葉松和華北落葉松)和12號(hào)染色體上具有特異擴(kuò)增條帶信號(hào)。 本研究進(jìn)一步將以上研究結(jié)果與其它松科植物進(jìn)行了比較，對(duì)落葉松屬基因組組構(gòu)及系統(tǒng)位置進(jìn)行了初步探索；應(yīng)用構(gòu)建的分子核型，進(jìn)行了種間核型比