日本落葉松X興安落葉松RAPD、SSR遺傳圖譜構(gòu)建與QTL定位.pdf

1、落葉松是我國北方主要造林及用材樹種,在建筑材、紙漿材等方面發(fā)揮重要作用。本研究選用黑龍江省牡丹江市林口縣青山林場的日本落葉松(Larix kaempefri)×興安落葉松(L.gmelinii)及其145個(gè)F1個(gè)體為作圖群體,同時(shí)運(yùn)用RAPD(Random Amplified Polyrnorphic DNA)和SSR(Simple sequence repeat)構(gòu)建日本落葉松(Larixkaempefri)×興安落葉松(L.gmel

2、inii)的遺傳連鎖圖譜,并首次結(jié)合生長性狀(樹高、胸徑、冠幅和材積)、材性性狀(木材密度、管胞長度、管胞寬度和管胞長寬比)進(jìn)行QTLs定位分析,為落葉松分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。
　　 1.通過文獻(xiàn)檢索獲得適合落葉松的SSR、搜索EST序列設(shè)計(jì)EST-SSR引物。通過文獻(xiàn)檢索得到SSR引物118對;登陸NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫搜索EST序列,共獲EST序列40605條,應(yīng)用SSRIT軟件在線搜索EST-SSR位點(diǎn),用Pr

3、imer3設(shè)計(jì),共設(shè)計(jì)EST-SSR引物796對。
　　 2.通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了落葉松RAPD-PCR、SSR-PCR反應(yīng)體系。確立適合于本研究群體的RAPD-PCR反應(yīng)體系為:20μl的反應(yīng)體系中,TaqDNA聚合酶為1U,Mg2+3.0mmol·L-1,dNTP0.25 mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,模板DNA50 ng;確立SSR-PCR反應(yīng)體系為:20μL的反應(yīng)體系中,TaqDNA聚合酶為1U,Mg2+3

4、.0mmol·L-1,dNTP0.25mmol·L-1,上下游引物各0.45μmol·L-1,模板DNA50 ng。
　　 3.篩選RAPD引物210個(gè)、SSR引物17對,共獲得603個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(581個(gè)RAPD、22個(gè)SSR)。平均每個(gè)RAPD引物獲得2.8個(gè)標(biāo)記位點(diǎn),每對SSR引物獲得1.3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn),擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段長度多數(shù)在150-2000 bp之間。x2檢驗(yàn)(x20.05(1)=3.84)檢驗(yàn)結(jié)果顯示,擴(kuò)增位點(diǎn)中

5、,444個(gè)位點(diǎn)符合1:1擬測交分離(日本落葉松220/興安落葉松224),46個(gè)位點(diǎn)符合3:1分離(日本落葉松29/興安落葉松17),113個(gè)位點(diǎn)屬于偏分離位點(diǎn)。有308個(gè)位點(diǎn)來自日本落葉松,占51.08％,295個(gè)位點(diǎn)來自興安落葉松,占48.92％。
　　 4.利用JoinMap3.0設(shè)置最小LOD值≥3.0,重組率≤0.45進(jìn)行遺傳作圖,通過對擬測交分離位點(diǎn)進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖分析,構(gòu)建了日本落葉松×興安落葉松遺傳連鎖圖譜。日本落葉

6、松中的48個(gè)連鎖標(biāo)記構(gòu)成了5個(gè)不同的連鎖群(4個(gè)以上標(biāo)記),4個(gè)三連體和6個(gè)連鎖對,168個(gè)為非連鎖位點(diǎn),平均圖距11.9cM。而來自興安落葉松的91個(gè)標(biāo)記構(gòu)成了9個(gè)連鎖群(4個(gè)以上標(biāo)記),2個(gè)三連體和5個(gè)連鎖對,128個(gè)為非連鎖位點(diǎn),平均圖距6.1cM。估算的日本落葉松遺傳圖譜框架圖和連鎖群總長度為290.1cM和546.5cM,估算的興安落葉松遺傳圖譜框架圖和連鎖群總長度分別為147.7cM和262.0cM。
　　 5.對構(gòu)

7、圖群體生長性狀進(jìn)行測定,包括樹高、胸徑、冠幅、材積等生長性狀,并同時(shí)進(jìn)行木材密度(Wood Specific Gravity,WSG)、管胞長度(Tracheid Length,TL)、管胞寬度(Tracheid Width,TW),和管胞長寬比的測定。變異分析結(jié)果表明,日×興F1群體內(nèi)個(gè)體間生長性狀、材性性狀均存在較大變異,并且生長性狀與材性性狀間存在相關(guān)。
　　 6.通過標(biāo)記位點(diǎn)與性狀間的關(guān)聯(lián)分析,獲得生長性狀和材性性狀QT

8、Ls。采用WinQTLCart2.5對群體的數(shù)量性狀進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖,以似然比LOD值≥1.5為閡值對QTL進(jìn)行定位分析。通過標(biāo)記位點(diǎn)與性狀間的關(guān)聯(lián)分析,獲得與生長性狀關(guān)聯(lián)的QTL標(biāo)記位點(diǎn)4個(gè),獲得與材性性狀相關(guān)的QTLs20個(gè),其中,日本落葉松管胞長度和管胞長寬比QTLs各1個(gè),興安落葉松木材密度QTLs9個(gè)、管胞長度QTLs4個(gè)和管胞寬度QTLs5個(gè)。各QTLs的LOD值在1.5～11.9,貢獻(xiàn)率在0.0105％～45.9986％。