巖青蘭黃酮的心肌保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是危害人類健康的嚴(yán)重疾病，具有“發(fā)病率高，死亡率高，致殘率高，復(fù)發(fā)率高”以及“并發(fā)癥多”的特點(diǎn)。近年來(lái)CVD的死亡率仍居世界前列，達(dá)世界死亡人數(shù)的20％，特別是45歲以上男性，65歲以上女性極易出現(xiàn)心血管癥狀，如心肌梗塞，高血壓，心衰，冠心病等，尤其是近年來(lái)發(fā)病年齡的年輕化，對(duì)人們的健康造成極大威脅。過(guò)去CVD被認(rèn)為屬于血流動(dòng)力學(xué)紊亂的范疇，近年來(lái)的治療政策逐漸

2、轉(zhuǎn)向?qū)膊“l(fā)展的控制，最近研究認(rèn)為，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可能是CVD發(fā)生、發(fā)展的重要參與者，ROS可導(dǎo)致心血管功能失調(diào)，細(xì)胞凋亡和壞死，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)破壞，脂質(zhì)與蛋白代謝與功能的改變，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，基因表達(dá)改變等。因此理論上說(shuō)抗氧化治療對(duì)CVD有很大價(jià)值。 阿霉素(Doxorubicin，DXR or DOX)屬葸醌類抗腫瘤抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強(qiáng)的特點(diǎn)，在臨床上廣泛用于治療白血

3、病、淋巴瘤等多種惡性腫瘤，因此是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，但長(zhǎng)期應(yīng)用可以發(fā)生劑量依賴性心臟毒性。用藥早期即可出現(xiàn)各種心律失常，晚期出現(xiàn)劑量依賴性充血性心力衰竭，表現(xiàn)為不可逆的慢性心肌改變。與其他抗腫瘤藥如環(huán)磷酰胺、博萊霉素、順鉑等合用時(shí)，其心臟毒性進(jìn)一步加重，一旦心力衰竭發(fā)生，其病死率可達(dá)33％-70％，因而大大限制了其在臨床上的應(yīng)用。 中藥作用范圍廣，毒副作用少，能有效地清除氧自由基抗脂質(zhì)過(guò)氧化和調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)定，從而保護(hù)心血

4、管系統(tǒng)及阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷。因此，從天然植物中尋找新型、高效、低毒的，具有多靶位調(diào)節(jié)作用的防治藥物仍是藥學(xué)研究的重點(diǎn)之一。 我國(guó)有著豐富的植物資源，巖青蘭(Dracocephalum rupestre Hance)又名毛建草，為多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)遼寧、內(nèi)蒙、河北、山西、青海等地。全草藥用可清熱消炎、涼血止血，主治外感風(fēng)熱、頭痛寒熱、喉痛咳嗽、黃疸性肝炎、吐血衄血、痢疾以及外感夾食、胸脘脹滿、消化不良等。其地上全草

5、所含總黃酮給麻醉犬靜脈滴注可以有效緩解急性心肌缺血，同時(shí)縮小犬急性心肌梗死面積；犬冠脈流量明顯增加。為了尋找對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用的有效成分，開發(fā)利用該植物資源，本教研室對(duì)該植物地上全草進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，共分離得到多個(gè)黃酮類化合物及其苷類化合物。 氧化損傷是心血管疾病和阿霉素心肌損傷的機(jī)制之一，故研究藥物的抗氧化分子機(jī)制，對(duì)于揭示藥物治療心血管疾病和阿霉素心肌損傷具有重要意義。在心肌細(xì)胞上表達(dá)的抗氧化調(diào)節(jié)基因和蛋白主要有N

6、rf2，AREs，ERK1/2等。介導(dǎo)細(xì)胞氧化還原反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是和Nrf2/ARE和MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 Nrf2在細(xì)胞漿中與胞漿骨架蛋白-1(cytoskeletal protein 1，Keap 1)結(jié)合而呈失活狀態(tài)，Nrf2在細(xì)胞漿中磷酸化后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，相應(yīng)于PKC和MAP激酶途徑。在細(xì)胞核中，Nrf2通過(guò)與bZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子包括CREB、ATF4、fos或jun結(jié)合而激活A(yù)REs，從而調(diào)節(jié)二相酶GST

7、-A2，NQO-1，HO-1，GCL，epoxide hydrolase，和UDP-glucuronosyl transferase等的表達(dá)。此過(guò)程被小maf蛋白包括MafG和MarK所拮抗。另外，心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致阿霉素性心肌病的主要原因。氧化損傷和鈣超載均能導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，凋亡通路中Bcl-2和Caspase家族發(fā)揮著重要作用。所以藥物可以從保護(hù)氧化損傷、降低鈣超載、作用于通路中的某個(gè)環(huán)節(jié)或通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)而保護(hù)心肌細(xì)胞。

8、 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，以阿霉素造成心肌損傷模型，觀察巖青蘭黃酮對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，主要研究柚皮素-7-0-葡萄糖苷的抗氧化機(jī)制和抗心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，分析阿霉素心肌損傷的發(fā)病機(jī)制中多個(gè)機(jī)制尤其是氧自由基和鈣超載以及最終引起心肌細(xì)胞凋亡之間的相互關(guān)系和交叉點(diǎn)，并進(jìn)一步從分子水平上闡明該類化合物心肌保護(hù)作用的分子靶點(diǎn)，對(duì)開發(fā)新的心血管藥物和減少阿霉素的心臟毒性提高其臨床應(yīng)用的安全性具有重要的理論

9、和實(shí)踐意義。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.用MTT法對(duì)5種巖青蘭黃酮的藥理活性進(jìn)行初步的篩選，觀察其不同劑量(2.5、5、10、20、40、80μM)對(duì)正常心肌細(xì)胞和損傷的心肌細(xì)胞的增殖作用的影響，檢測(cè)正常心肌細(xì)胞、阿霉素(20μM)損傷的心肌細(xì)胞、及加入巖青蘭黃酮(2.5、5、10、20、40、80μM)作用的各組心肌細(xì)胞吸光度。觀察柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40、80μM)對(duì)阿霉素(20μM)損傷的心肌細(xì)胞活力影響的

10、時(shí)效關(guān)系，應(yīng)用試劑盒檢測(cè)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH及GSH-Px的水平和MDA的含量的影響。 2.不同劑量柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對(duì)阿霉素(10μM)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)：1)瑞氏-吉姆薩和Heochst33258染色后，分別于倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察正常、凋亡、加藥保護(hù)的各組細(xì)胞的形態(tài)。2)瓊脂糖凝膠電泳分析(DNA ladder

11、)；3)流式細(xì)胞儀分析-磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V/PI雙染法)；4)RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2和HO-1 mRNA的表達(dá)；5)Western blot檢測(cè)Bcl-2，HO-1的蛋白表達(dá)：6)用Fura-2/AM鈣熒光探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 3.不同劑量柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對(duì)內(nèi)源性抗氧化酶的誘導(dǎo)作用：1)RT-PCR檢測(cè)柚皮素-7-O-

12、葡萄糖苷對(duì)心肌細(xì)胞GCLM、GCLC和NQO1 mRNA的表達(dá)；2)Western blot檢測(cè)柚皮素-7-O-葡萄糖苷對(duì)NQO1的蛋白表達(dá)；3)Western blot檢測(cè)柚皮素-7-O-葡萄糖苷對(duì)Nrf2的核轉(zhuǎn)位和磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響。結(jié)果： 1.通過(guò)用MTT法對(duì)5種巖青蘭黃酮(北美圣草素、北美圣草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷及化合物 6)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行初步的篩選發(fā)現(xiàn)，低劑量(2.

13、5、5、10、20、40μM)的巖青蘭黃酮對(duì)正常心肌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響，隨著劑量增加，表現(xiàn)出對(duì)心肌細(xì)胞的增殖有抑制作用；阿霉素?fù)p傷的心肌細(xì)胞的增殖作用明顯下降。低劑量(2.5、5、10、20、40μM)巖青蘭黃酮對(duì)阿霉素?fù)p傷的心肌細(xì)胞有不同程度的保護(hù)作用，其中柚皮素-7-O-葡萄糖苷的保護(hù)作用較好。柚皮素-7-O-葡萄糖苷能提高阿霉素?fù)p傷的心肌細(xì)胞內(nèi)GSH水平，降低MDA含量，并增強(qiáng)SOD、CAT和GSH-Px的活性，從而對(duì)阿霉素誘導(dǎo)

14、的心肌損傷有一定保護(hù)作用。 2.柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能保護(hù)阿霉素(10μM)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡： 1)形態(tài)學(xué)觀察：瑞氏-吉姆薩和Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)正常心肌細(xì)胞核形態(tài)完整，核膜清晰，染色均勻，未見核固縮現(xiàn)象。阿霉素(10μM)處理的細(xì)胞部分染色質(zhì)出現(xiàn)固縮、染色質(zhì)不均勻有邊集現(xiàn)象，部分染色質(zhì)呈典型半月樣改變；有的形成顆粒，細(xì)胞核裂解，產(chǎn)生凋亡小體。柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20

15、、40μM)細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，少數(shù)有染色質(zhì)輕度邊集、核固縮等形態(tài)學(xué)變化。隨著劑量增大，細(xì)胞保護(hù)作用減弱。 2)瓊脂糖凝膠電泳分析(DNA ladder)發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能減少阿霉素(10μM)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡帶。 3)Annexin V/PI雙染后流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能保護(hù)阿霉素(10μM)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，能降低凋亡率。 4)

16、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能減少心肌細(xì)胞Caspase-3，Caspase-9 mRNA的表達(dá)，增加Bcl-2和HO-1 mRNA及其蛋白表達(dá)；并能降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。 3.對(duì)內(nèi)源性抗氧化酶的誘導(dǎo)作用：柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能增加心肌細(xì)胞GCIM、GCLC和NQO1 mRNA的表達(dá)；上調(diào)NQO1的蛋白表達(dá)：增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位和磷酸化ERK1/2表達(dá)。

17、 結(jié)論： 柚皮素-7-O-葡萄糖苷對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷有一定保護(hù)作用，能提高損傷心肌細(xì)胞內(nèi)GSH水平，降低MDA含量、增強(qiáng)SOD、CAT和GSH-Px活力。能抑制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、減少Caspase-3，Caspase-9 mRNA的表達(dá)、增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶GCL、HO-1和NQO1的表達(dá)而對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，結(jié)果初步證實(shí)柚皮素-7-O-葡萄糖苷能通過(guò)增加Nrf2核轉(zhuǎn)