玉郎傘黃酮和柿子葉黃酮對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機制研究.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的發(fā)生和發(fā)展過程是一個多因素相互作用的級聯(lián)反應(yīng)，主要的損傷機制有自由基損傷、鈣超載、微血管損傷和白細(xì)胞的作用等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，補體、選擇素、內(nèi)皮素和細(xì)胞凋亡等均參與了MIRI的病理變化過程。可見，MIRI可能是多分子、多機制、相互影響、相互促進(jìn)的病理變化。至今MIRI一直是心肌缺血治療中難以解決的問題。
　　 我國中藥資

2、源豐富，從中尋找防治MIRI的安全有效藥物，特別是對其活性成分進(jìn)行藥效學(xué)及作用機制的研究，對于開發(fā)我國豐富的中藥資源和促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。
　　 多年來，本課題組一直致力于發(fā)掘廣西豐富的民族草藥資源，篩查副作用小、療效較好的廣西民族草藥/活性部位。我們前期開展了大量的基礎(chǔ)研究工作，階段性實驗發(fā)現(xiàn)：(1)從玉郎傘分離得到的玉郎傘黃酮(YLSF)預(yù)處理能明顯降低MIRI大鼠血漿中AST、LDH、LDH1和MDA含量，能提高S

3、OD活性，降低心肌梗死范圍。提示，YLSF對大鼠心肌MIRI具有顯著的保護(hù)作用。此外，兩種YLS單體對體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，其機制可能與清除自由基、抑制心肌細(xì)胞Ca2+超載有關(guān)；進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，YLS兩種黃酮單體尚具有抗氧化、耐缺氧、抗凝血以及有較強的清除自由基的作用。(2)從柿葉提取得到的PLF可顯著改善MIRI所致的大鼠離休心功能損傷，減少CK、CK-MB、LDH、LDH1的釋放和心肌組織MDA的產(chǎn)生

4、，增加SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性，說明，PLF對大鼠MIRI具有保護(hù)作用，其機制可能與提高SOD活性、抗氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。而研究PLF對血壓的影響，發(fā)現(xiàn)PLF對正常大鼠和L-NAME誘導(dǎo)的高血壓大鼠的血壓和心率均有降低作用。另一研究證明，PLF可能是通過增加內(nèi)源性舒血管活性物質(zhì)的釋放和減少內(nèi)源性收縮血管活性物質(zhì)的釋放來調(diào)節(jié)兩者之間的平衡而發(fā)揮其抗高血壓作用。
　　 總之，前期研究表明

5、，YLSF和PLF對大鼠MIRI具有明顯的保護(hù)作用，其作用機制與抗氧化、清除氧自由基等多個環(huán)節(jié)有關(guān)。為了更進(jìn)一步地了解YLSF和PLF對大動物(猴、犬)MIRI的影響，完善其臨床前研究，我們分別用猴和犬MIRI模型，研究YLSF和PLF對MIRI的保護(hù)作用，研究分兩部分：
　　 第一部分：玉郎傘黃酮對猴心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機制研究目的：研究玉郎傘黃酮(YLSF)對猴心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護(hù)作用及其機制。

6、r>　　 方法：將實驗猴隨機分為5組，每組4只：假手術(shù)(SHAM)組、心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型組、YLS黃酮低劑量組(YLSFL)組、YLS黃酮高劑量(YLSFH)組、地爾硫卓陽性藥(DIL)組。缺血前30min經(jīng)十二指腸注射給藥。結(jié)扎冠狀動脈左前降支60min后，再灌注180min，建立MIRI模型。再灌注結(jié)束后測定下列各項指標(biāo)：(1)利用MPA心功能分析系統(tǒng)觀察并紀(jì)錄在急性缺血和再灌注狀態(tài)下血流動力學(xué)指標(biāo)(HR、LVSP

7、、Lvedp、+dp/dtmax、-dp/dtmax)的變化。(2)取缺血區(qū)的心肌組織，常規(guī)制作組織切片、電鏡切片，光鏡、電鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化并拍照。(3)從股靜脈脈采血，離心，取上層血清，測定AST、LDH、LDH1、CK、CK-MB、SOD、GSH-Px、TNOS、MDA和NEFA；取缺血區(qū)心肌組織，按試劑盒說明測定Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性。(4)取缺血區(qū)心肌組織，測定心肌組

8、織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)、核因子-κB表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡、心肌ANT1、Caspase-3mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)YLSF對心臟血流動力學(xué)的影響：與模型組比較，YLSFH、YLSFL組在再灌注180min時對LVSP、+dp/dtmax有明顯的提高作用，而對HR、LVDEP和-dp/dtmax的作用不明顯。(2)YLSF對血液生化學(xué)指標(biāo)的影響：YLSF能明顯下調(diào)各心肌酶、MDA和NEFA含量；提高SOD、G

9、SH-Px、Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性。(3)YLSF對心肌組織形態(tài)學(xué)的影響：從組織病理學(xué)角度上看，與模型組比較，YLSF給藥組心肌受損程度明顯減輕。(4)YLSF對相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)、核因子-κB表達(dá)的影響：YLSFH、YLSFL組均能明顯降低心肌Bax蛋白表達(dá)，能顯著增加Bcl-2/Bax的比率。YLSFH能明顯增加Bcl-2蛋白表達(dá)，而YLSFL則對Bcl-2蛋白表達(dá)無影響。YLSF給

10、藥組NF-κBp65表達(dá)降低，陽性細(xì)胞百分率下降。(5)YLSF對心肌細(xì)胞凋亡的影響：YLSFH組可減輕心肌細(xì)胞凋亡程度。(6)YLSF對心肌ANT1、Caspase-3mRNA表達(dá)的影響：與MIRI組比較，YLSFH組、YLSFL組ANT1mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，YLSH組Caspase3的mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。(7)YLSF對心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響：YLSF能明顯減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的破壞。
　　 結(jié)論：Y

11、LSF對猴MIRI具有顯著的保護(hù)作用，其機制可能與改善心功能、抗脂質(zhì)過氧化損傷、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)、增加Bcl-2/Bax的比率，下調(diào)NF-κBp65表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡程度，以及上調(diào)ANT1mRNA的表達(dá)以及通過下調(diào)Caspase3mRNA的表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分：柿葉黃酮對犬心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機制研究
　　 目的：研究柿葉黃酮(PLF)對犬心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護(hù)作用并對其機制進(jìn)行初步探

12、討。
　　 方法：選取實驗用比格犬隨機分為5組，每組6只：假手術(shù)組、心肌缺血再灌注損傷(MIRI)組、柿葉黃酮低劑量(PLFL)組、柿葉黃酮高劑量(PLFH)組、地爾硫卓(DIL)組。缺血前30min經(jīng)十二指腸注射給藥。結(jié)扎冠狀動脈左前降支60min后，再灌注180min，建立MIRI模型。再灌注結(jié)束后測定下列各項指標(biāo)：(1)利用MPA心功能分析系統(tǒng)觀察并紀(jì)錄在急性缺血和再灌注狀態(tài)下血流動力學(xué)指標(biāo)(HR、LVSP、Lvedp、+

13、dp/dtmax、-dp/dtmax、IT、ET、IT/ET)的變化。(2)取缺血區(qū)的心肌組織，常規(guī)制作組織切片、電鏡切片，光鏡、電鏡下觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的變化并拍照。(3)從股靜脈脈采血，離心，取上層血清，按試劑盒說明測定AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1，SOD、GSH-Px和TNOS的活性、MDA和NEFA含量；取缺血區(qū)心肌組織，按試劑盒說明測定AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1，SOD、GSH-Px、

14、TNOS、ATP酶的活性、MDA和NEFA含量。(4)取缺血區(qū)心肌組織，免疫組化法測定Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)與MIRI組相比，在再灌注180min(r180min)時，PLFH組HR、LVSP、+dp/dtmax、ET顯著高于MIRI組(P＜0.01或P＜0.05)，而Lvedp、-dp/dtmax、IT、IT/ET顯著低于MIRI組(P＜0.01或P＜0.05)。(2)光鏡下觀察，MIRI組心肌纖維排

15、列紊亂、腫脹、部分?jǐn)嗔眩踔脸霈F(xiàn)片狀壞死，周圍有炎性細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞漏出明顯。PLFL、PLFH組的損傷明顯減輕。電鏡下觀察，MIRI組的心肌細(xì)胞的肌絲、線粒體、閏盤等破壞明顯，而PLFL、PLFH組則明顯減輕。(3)與MIRI組比較，PLF能顯著抑制血清中心肌酶活性和MDA、NEFA含量的提高，抑制血清中SOD、GSH-Px、TNOS活性的降低(P＜0.01或P＜0.05)；PLF還能同時降低組織中MDA和NEFA含量，提高心肌酶、S

16、OD、GSH-Px和ATP酶的活性(P＜0.01或P＜0.05)。(4)與MIRI組比較，PLFL、PLFH組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增高(P＜0.01或P＜0.05)，而NF-κBp65、Bax蛋白表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 結(jié)論：柿PLF對MIRI具有明顯的保護(hù)作用。其抑制可能與抗脂質(zhì)過氧化損傷、保護(hù)ATP酶活性、降低NEFA含量、提高TNOS活性、改善心功能和抑制心肌細(xì)胞凋亡