轉(zhuǎn)il-4基因大白菜(Brassica pekinensis)及其雜交后代的分子檢測(cè)及il-4遺傳、表達(dá)研究.pdf

1、本研究以花粉管通道法轉(zhuǎn)化得到的il-4基因大白菜（Brassica pekinensis）哈白二號(hào)、濰白六號(hào)和新世紀(jì)三個(gè)品種為試驗(yàn)材料，通過 PPT、Kna抗性篩選、PCR擴(kuò)增、PCR-Southern雜交、ELISA和Western雜交等技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)il-4基因大白菜后代進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，同時(shí)對(duì)il-4基因在T5、T6、T7代自交大白菜中的傳遞規(guī)律和表達(dá)情況進(jìn)行了探討。并對(duì)已經(jīng)檢測(cè)的自交后代陽性株不同株系間進(jìn)行雜交，試圖提高后代陽性率

2、和蛋白表達(dá)量。另外，對(duì)陽性后代植株表型、抗病性進(jìn)行了調(diào)查。
　　本研究中，共播轉(zhuǎn)il-4基因T5代種子608粒，實(shí)際出苗421株，得到280株P(guān)PT抗性株，植株的PPT的抗性分離情況都符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德爾分離規(guī)律。PCR檢測(cè)il-4陽性株26株，陽性率為6.18％。T6代播種1536粒，實(shí)際出苗1108株，其中1007株篩選得到PPT抗性356株，其它101株直接進(jìn)行PCR檢測(cè)。PPT的抗性分離情況除哈白AH-

3、3-1-5-23-10、哈白AH-2-10-46-92-13、哈白BH-1-5-4-12-21、新世紀(jì)BL-1-37-72-4-5、濰白AH1-447-49-1-33外，其余均不符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德爾分離規(guī)律。PCR檢測(cè)陽性株44株，陽性率為3.97%。T7代播種918粒，實(shí)際出苗580株，其中339株經(jīng)篩選得到PPT抗性135株，其它241株直接進(jìn)行 PCR檢測(cè)。PPT的抗性分離情況除了哈白AH-3-1-5-23-2

4、-2外沒有符合孟德爾分離規(guī)律的植株。PCR檢測(cè)得到陽性株13株，陽性率僅為2.24%。
　　在Kna抗性篩選過程中，T5代共播種子772粒，實(shí)際出苗378株，篩選得到Kna陽性株226株，Kna抗性分離情況符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德爾分離規(guī)律的植株有：哈白EL-1-3-121-11、哈白EL-1-3-47-26、哈白EL-1-3-121-12、哈白EL-1-3-121-1、哈白EL-1-3-47-44、哈白EL-1-3

5、-47-24、哈白EL-1-3-3-4。PCR檢測(cè)得到陽性株18株，陽性率為4.76%。il-4的分離情況，除哈白EL-1-3-121-11、哈白EL-1-3-47-24植株外，均不符合陽性植株數(shù):陰性植株數(shù)=3:1孟德爾分離規(guī)律。T6代共播種子787粒，實(shí)際出苗673株，其中660株經(jīng)Kna篩選得到陽性株192株，其它13株直接進(jìn)行PCR檢測(cè)。Kna抗性分離情況都不符合抗性植株:非抗性植株=3:1的孟德爾分離規(guī)律。PCR檢測(cè)得到陽性株

6、11株，陽性率僅為1.63%。待測(cè)雜交F1代幼苗225株，直接進(jìn)行PCR檢測(cè)得到陽性株5株，陽性率僅為2.22%。遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理論值。
　　從PCR檢測(cè)為陽性的植株中隨機(jī)抽取7個(gè)樣品進(jìn)行PCR-Southern雜交，結(jié)果顯示被檢樣品有6株為陽性，表明il-4在轉(zhuǎn)化后代中仍然存在。對(duì)其中5株進(jìn)行Western雜交，其中3株出現(xiàn)雜交條帶，更加證明IL-4已經(jīng)在后代中穩(wěn)定遺傳并表達(dá)。對(duì)包括雜交株在內(nèi)的11個(gè)陽性樣品進(jìn)行 ELISA檢測(cè)，結(jié)果