重組人IL-4、IL-13的克隆、表達和鑒定.pdf

1、目的:白細胞介素(interleukin，IL)是非常重要的細胞因子家族，在調(diào)節(jié)細胞生長分化、免疫細胞的活化與分化、調(diào)節(jié)免疫應答、誘導炎癥發(fā)生過程中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的成員已達35個，被命名為IL-1～IL-35。IL-4和IL-13主要由活化的CD4+ Th2細胞產(chǎn)生，活化的肥大細胞等也可產(chǎn)生。IL-4和IL-13共享信號傳導系統(tǒng)，二者都可與靶細胞上由IL4Rα鏈和IL13Rα1鏈組成的受體復合物結(jié)合，從而將信號傳導到胞漿，故二者部

2、分功能重疊。IL-4和IL-13可通過激活嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞促進氣道炎癥，增強纖維母細胞的增殖與活化引起氣道重塑;激活B細胞產(chǎn)生IgE;刺激氣道上皮細胞、杯狀細胞產(chǎn)生黏液;激活氣道平滑肌細胞引起氣道高反應性，在過敏性炎癥疾病中起著重要的作用?；贗L-4/IL-13信號途徑在過敏性炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用，可通過阻斷IL-4/IL-13信號傳導干預治療過敏性炎癥疾病，但以往研究表明，抗IL-4和抗IL-13的單克隆抗體用

3、于治療過敏性炎癥疾病，未取得滿意效果。因此，制備中和性抗IL-4和IL-13雙特異性抗體，以封阻它們的生物學活性，對于過敏性炎癥疾病的治療具有很大的潛力。本研究克隆、表達及鑒定了人IL-4和IL-13重組蛋白，為后期雙特異性抗體的制備奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.從健康志愿者外周血中分離PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單個核細胞)，提取總RNA，從NCBI(National Cent

4、er ofBiotechnology Information，美國國家生物技術(shù)信息中心)下載人IL-4和IL-13 mRNA序列，設(shè)計引物，采用RT-PCR擴增IL-4和IL-13 cDNA。2.將PCR產(chǎn)物與pET101/D-TOPO載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOPO10，菌落PCR驗證基因插入是否正確，提取重組質(zhì)粒送上海生物技術(shù)有限公司進行測序驗證。3.將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量表達，SDS-PAGE（sodi

5、um dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析篩選高表達量克隆子。4.篩選到的高表達量克隆子用1 mmol/L IPTG（isopro pyl-β-d-thiogalactoside，異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）誘導表達，按Invitrogen公司的Ni-NTA純化試劑盒的變性條件純化蛋白。5.Western blot鑒定表達的融合蛋白

6、。
　　結(jié)果:1.PCR最終擴增得到IL-4開放閱讀框基因，其大小為460 bp左右;擴增得到IL-13開放閱讀框基因，其大小為430 bp左右，測序驗證序列正確。2.IL-4/pET101和IL-13/pET101重組質(zhì)粒測序驗證序列正確。3.誘導表達后的IL-4融合蛋白條帶大小為28 kDa左右，與目的蛋白大小一致。相同條件下4個克隆子中IL4-1表達量最高，其次是IL4-2和IL4-4，IL4-3基本無表達;誘導表達后的IL

7、-13融合蛋白條帶大小為26 kDa左右，與目的蛋白大小一致。4.將大量表達的IL4-1和IL-13應用Ni-NTA親和純化柱在變性條件下進行了純化。結(jié)果表明:純化的IL-4蛋白在28kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致;純化的IL-13在26kDa處出現(xiàn)了單一條帶，與目的蛋白大小一致。5.將表達的IL4-1蛋白和IL-13蛋白進行Western blot驗證，結(jié)果顯示，表達的蛋白即為目的蛋白IL-4和IL-13。
　　結(jié)論