硅提高豇豆銹病抗性機(jī)理及抗銹病分子標(biāo)記研究.pdf

1、豇豆銹病(Uromyces vignae Barclay)為生產(chǎn)上普遍發(fā)生的一種全國性病害，已，對生產(chǎn)構(gòu)成較大威脅。尋找防治銹病的新方法和選育抗銹病新品種已成為長豇豆(Vigna unguiculata ssp．sesquipedlis(L.)Verd.)科研和生產(chǎn)上的重要課題。 雖然硅并沒有被認(rèn)為植物的必需元素之一，但硅在提高植物對生物脅迫和非生物脅迫抗性方面的作用已引起了廣泛關(guān)注。研究表明，硅可提高黃瓜、瓠瓜、水稻、大麥、小

2、麥等植物的抗病性。目前，硅提高植物抗真菌病害作用的研究大多集中在含硅量高(占干重1-10％)的水稻、大小麥等禾本科植物和黃瓜、甜瓜等作物上，而在含硅量低的豆科植物上的研究甚少。 傳統(tǒng)的抗病育種依賴于抗性鑒定和植株表型選擇，要求有豐富的經(jīng)驗和長達(dá)數(shù)年甚至十幾年的時間，并需要創(chuàng)造特殊環(huán)境進(jìn)行篩選鑒定。分子標(biāo)記輔助育種(MAS)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種學(xué)相結(jié)合的新方法，它的應(yīng)用可以顯著縮短育種進(jìn)程，提高選擇效率，在抗病育種中極具

3、應(yīng)用價值。研究獲得與長豇豆抗銹病基因連鎖的分子標(biāo)記對于分子標(biāo)記輔助育種和圖位克隆基因意義重大。 本研究(1)以高抗銹病品種‘ZN0.16’和高感銹病品種‘之豇282’為材料，采用基質(zhì)栽培，在細(xì)胞或亞細(xì)胞器水平研究了外源硅(K<,2>SiO<,3> 1.7 mM)和接種銹菌對長豇豆幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合作用、活性氧及抗氧化系統(tǒng)等的影響，旨在闡明硅提高長豇豆對銹病抗性的生理生化機(jī)制；(2)以上述兩品種為雙親構(gòu)建的F<,2>群體為試

4、材，采用分離群體分組分析法(BSA法)和AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，將獲得的與長豇豆抗銹病相關(guān)基因連鎖的AFLP標(biāo)記進(jìn)行SCAR轉(zhuǎn)化。所取得的主要結(jié)果如下： 1、外源硅可顯著減少長豇豆感病品種接種銹菌后葉片凈光合速率(P<,n>)、氣孔導(dǎo)度(G<,s>)的下降幅度和胞間CO<,2>濃度(Ci)的上升幅度，維持葉片較高的光合效率：可維持幼苗葉片較高的總呼吸活性(V<,t>)、替代途徑能力(V<,alt>)和替代途徑實(shí)際運(yùn)行活性(pV<,

5、alt>)；明顯延緩植株葉片F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ф<,PSⅡ>、NPQ、Fv'/Fm，、Rfd和ETR等葉綠素?zé)晒鈪?shù)的下降時間，減輕其下降程度；未接種時外源硅對上述參數(shù)無明顯影響。硅與銹菌對抗病品種的上述參數(shù)也無明顯影響。外源加硅使豇豆植株葉片中SiO<,2>含量比對照提高36.42％。硅可顯著降低感病品種的銹病病情指數(shù)，相對防效達(dá)31.7％。 2、接種銹菌后，外源硅能明顯提高感病品種和抗病品種葉片中相關(guān)酶如過氧化物酶(P

6、OD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等的活性，降低超氧陰離子自由基(O<,2><'->)產(chǎn)生速率，減少H<,2>O<,2>和丙二醛(MDA)含量，提高酚類物質(zhì)、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)含量；硅對感病品種比抗病品種的效果更為顯著。在無病原菌侵入時，硅對葉片中上述抗病相關(guān)酶活性、氧自由基和膜脂過氧化物及抗氧化物含量無明顯影響

7、。POD同工酶分析表明，外源硅不能改變兩品種的POD同工酶譜帶。 3、外源硅顯著提高豇豆銹菌脅迫下葉片細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中POD、APX、CAT活性和感病品種的PAL活性，明顯提高兩品種各細(xì)胞器中SOD和GR活性；有利于抗感兩品種各細(xì)胞器中AsA和細(xì)胞質(zhì)、葉綠體中多酚含量的提高：顯著降低感病品種細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中MDA含量：豇豆銹病抗感兩品種間細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中的POD同工酶譜帶不同，在線粒體中無明顯差異，但外源加硅與否不能改變

8、其POD同工酶譜帶。硅可有效地減慢銹菌脅迫下感病品種葉綠素的降解速度；增加豇豆銹病抗感各品種線粒體膜電位(△ф<,M>)，降低線粒體膜腫脹度，提高線粒體的呼吸速率、細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)活力和ATP酶活性，且對感病品種的效應(yīng)要高于抗病品種。表明硅可能通過提高葉綠體、線粒體清除自由基的能力，提高線粒體ATPase與CCO活性，增強(qiáng)線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，來提高植株的呼吸作用和光合作用，最終提高植株對銹病的抗性。 4、通過對

9、構(gòu)建的不同分離群體進(jìn)行苗期人工接種鑒定，表明豇豆對銹病的抗性受一對顯性基因控制；建立了長豇豆AFLP分子標(biāo)記分析技術(shù)體系，應(yīng)用64對引物組合共擴(kuò)增出2019條帶，平均每對引物組合擴(kuò)增的條帶數(shù)為31.55條；多態(tài)性條帶共124條，其中12對引物組合未出現(xiàn)多念性條帶，平均每對引物組合擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為2.0條；篩選出在抗池、感池和雙親DNA池間穩(wěn)定表現(xiàn)多態(tài)的引物組合2對：E-AAG/M-CTG和E-ACC/M-CTG。 5、通過將特

10、異片段回收、克隆和測序，E-AAG/M-CTG特異片段全長為150bp，E-ACC/M-CTG特異片段全長為321 bp。分別設(shè)計特異SCAR引物，再對F<,2>代單株基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，針對E-AAG/M-CTG特異片段設(shè)計的SCAR引物僅在抗病單株中擴(kuò)增出1條分子量為98 bp的特異帶，表明已成功地將與豇豆銹病抗性連鎖的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為操作簡便、表現(xiàn)穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。經(jīng)連鎖分析，該SCAR標(biāo)記與銹病抗性基因的連鎖距離