纖溶活性化合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶特性影響的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生物學(xué)過(guò)程的重要組成部分,是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。用 X射線衍射法確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對(duì)理解大分子結(jié)構(gòu)、藥物的作用機(jī)制、改變或修飾分子結(jié)構(gòu)并使之具有特定的應(yīng)用特性等有十分重要的意義。血栓性疾病是威脅人類(lèi)健康的主要疾患之一,臨床上使用的大部分溶栓藥品如肝素、阿昔單抗、尿激酶等會(huì)有出血性危險(xiǎn)、過(guò)敏反應(yīng)、特異性差等不良反應(yīng),因此,出血危險(xiǎn)性小、不損傷血液因子、活性能夠簡(jiǎn)單調(diào)控的溶栓藥物亟需出現(xiàn)。海洋纖溶活性化合物GDG和FGFC1是經(jīng)本研究

2、室研究確定的低分子纖溶活性化合物,能增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)中的纖溶活性。通過(guò)X射線衍射測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提是獲得適合X射線衍射結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)單晶,然而,獲得高質(zhì)量的單晶是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確定的瓶頸。雞蛋白溶菌酶(簡(jiǎn)稱 HEWL)由于其穩(wěn)定性,溶解性和易結(jié)晶性,已被結(jié)晶學(xué)家作為蛋白質(zhì)結(jié)晶理論的模板而被廣泛研究。
　　論文以HEWL結(jié)晶過(guò)程為例,研究不同的環(huán)境對(duì)其結(jié)晶行為的影響,研究纖溶活性化合物GDG和FGFC1對(duì)HEWL結(jié)晶特性的影響,并通過(guò)X

3、-射線衍射在低溫下收集了添加GDG的HEWL晶體的數(shù)據(jù),并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析;研究了GDG和FGFC1對(duì)纖溶因子尿激酶和鏈激酶的結(jié)晶影響。探索小分子化合物對(duì)大分子蛋白質(zhì)的作用機(jī)制,為蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系和新型溶栓藥物的設(shè)計(jì)與研制構(gòu)建理論支持。
　　第一章歸納了20世紀(jì)以來(lái)人們對(duì)血栓性疾病的研究進(jìn)展和新型溶栓藥物的溶栓機(jī)制,生物制藥與蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)系,利用同步輻射 X射線衍射確定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展。主要是對(duì)血栓疾病的形成機(jī)制與血栓病

4、危害,經(jīng)典溶栓藥物種類(lèi)及特性,纖溶活性化合物的溶栓機(jī)制,蛋白質(zhì)結(jié)晶與纖溶因子構(gòu)象研究,同步輻射光源衍射確定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的基本原理,溶菌酶的結(jié)晶特性研究進(jìn)行了總結(jié)。目前臨床上應(yīng)用的抗血栓藥物,大多數(shù)或因?yàn)樽⑸浣o藥、或因?yàn)椴涣挤磻?yīng)嚴(yán)重而不能作為日常用藥在長(zhǎng)時(shí)期反復(fù)使用,因此研制有效、安全、適于長(zhǎng)時(shí)期,甚至終生使用的口服抗血栓藥物具有重大的意義。從海藻中獲得的GDG和從海洋微生物中代謝產(chǎn)物中獲得的FGFC1是一種小分子化合物,已經(jīng)證實(shí)其具有

5、促進(jìn)血栓溶解的作用。本論文的研究目的是探索GDG和FGFC1對(duì)溶菌酶結(jié)晶特性的影響,利用同步輻射X射線衍射分析GDG和FGFC1與溶菌酶和纖溶因子的共結(jié)晶體三維空間結(jié)構(gòu),佐證針對(duì)確立的海洋纖溶活性化合物促進(jìn)血栓溶解特性,從構(gòu)象上研究纖溶活性化合物GDG和FGFC1對(duì)纖溶因子的影響,并對(duì)最終的GDG、FGFC1促進(jìn)血栓溶解作用特性做出相應(yīng)的補(bǔ)充和完善,發(fā)現(xiàn)小分子纖溶化合物作用新靶點(diǎn)及新藥先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。
　　第二章對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件

6、進(jìn)行了研究。主要介紹懸滴氣相擴(kuò)散法結(jié)晶的原理和方法,利用顯微鏡觀察溶菌酶晶體的表觀,篩選適合溶菌酶結(jié)晶的條件,并對(duì)篩選的結(jié)晶條件進(jìn)行小范圍的優(yōu)化,確定溶菌酶結(jié)晶的最優(yōu)條件,并分析結(jié)晶試劑、沉淀劑濃度、結(jié)晶溶液pH值、結(jié)晶溫度對(duì)溶菌酶晶體生長(zhǎng)的影響。確定了溶菌酶最優(yōu)的結(jié)晶條件為:15mg/ml溶菌酶,在含5％氯化鈉和0.02%疊氮化鈉, pH值5.2的0.1 M醋酸鈉緩沖溶液中,溶菌酶晶核數(shù)量較少,晶體尺寸最佳。
　　第三章研究纖溶

7、活性化合物對(duì)溶菌酶結(jié)晶特性的影響。根據(jù)添加劑對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響的基本理論,結(jié)合第二章篩選出的最優(yōu)溶菌酶結(jié)晶條件,將纖溶化合物GDG和FGFC1添加到溶菌酶溶液中,研究GDG與FGFC1共結(jié)晶條件。得到晶體后對(duì)晶體進(jìn)行顯微鏡觀察,分析添加GDG和FGFC1的溶菌酶晶體的表觀數(shù)據(jù),分析纖溶化合物對(duì)溶菌酶結(jié)晶特性的影響。結(jié)果表明,GDG可能會(huì)影響溶菌酶結(jié)晶,在相同的結(jié)晶條件下,加入GDG可以促進(jìn)晶核的形成。
　　第四章研究纖溶活性化合物

8、對(duì)溶菌酶晶體結(jié)構(gòu)的影響。基于第三章 GDG和FGFC1對(duì)溶菌酶結(jié)晶特性有影響,推測(cè)GDG和FGFC1可能影響了溶菌酶的分子結(jié)構(gòu),因此本章利用同步輻射X射線衍射GDG和FGFC1與溶菌酶的共結(jié)晶體,經(jīng)衍射數(shù)據(jù)收集與還原,解析空間三維空間結(jié)構(gòu),以小分子作用于大分子蛋白質(zhì)的機(jī)制為本章研究的理論基礎(chǔ),研究纖溶活性化合物對(duì)溶菌酶主鏈、側(cè)鏈、催化域、活性位點(diǎn)的影響。
　　第五章是對(duì)纖溶活性化合物影響纖溶因子晶體結(jié)構(gòu)的初步研究。目前本研究室已經(jīng)

9、發(fā)現(xiàn)海洋纖溶活性化合物GDG誘導(dǎo)纖溶因子構(gòu)象改變和活性變化的關(guān)系及其促進(jìn)血栓溶解的特性,有待進(jìn)一步確定GDG是否提高了纖溶因子如纖溶酶(原)、纖溶酶原激活劑等纖溶因子的活性,確定GDG是否降低了纖溶酶原激活物抑制劑、纖溶酶抑制劑等的活性,發(fā)現(xiàn)GDG促進(jìn)體內(nèi)纖溶作用的機(jī)制。本章具體針對(duì)GDG對(duì)尿激酶型纖溶酶原激活劑、鏈激酶型纖溶酶原激活劑晶體結(jié)構(gòu)做初步研究,利用懸滴結(jié)晶法研究GDG與尿激酶、鏈激酶的共結(jié)晶條件和結(jié)晶特性,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)晶條件