膜結晶法結晶蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、隨著重組DNA技術的發(fā)展和表達體系的完善，已知的蛋白質(zhì)數(shù)目有了很大增長。X射線衍射是確定蛋白質(zhì)結構的最有效方法，而X射線結晶學的應用要求大分子晶體具有足夠大的尺寸(大于0.1mm)和完美的質(zhì)量，以獲得精確的衍射數(shù)據(jù)。然而，許多生物大分子晶體常常難以成長，一般小分子結晶的方法都不適合于大分子的晶體生長。因此，獲得質(zhì)量完美的蛋白質(zhì)晶體成為蛋白質(zhì)結構測定的主要瓶頸，需要探索新的結晶方法以制備蛋白質(zhì)等生物大分子晶體。用膜結晶技術結晶蛋白質(zhì)可得到

2、適合于衍射分析的大分子蛋白質(zhì)晶體。
　　 本文首先用滲透膜結晶法進行了幾種蛋白質(zhì)(溶菌酶、木瓜蛋白酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白以及脂肪酶)的膜結晶，研究了操作條件對蛋白質(zhì)滲透膜結晶過程的影響，優(yōu)化了幾種蛋白質(zhì)的結晶條件，評價了不同結晶條件下的溶劑跨膜通量，探討了沉淀劑和添加劑對蛋白質(zhì)滲透膜結晶的作用機理，并對最后得到的蛋白質(zhì)晶體進行了初步分析。研究結果表明：
　　 對于溶菌酶的滲透膜結晶過程，氯化鈉和硫氰酸鈉為溶菌酶滲透膜

3、結晶的有效沉淀劑。結晶溶液中加入一定添加劑如丙三醇、PEG4000或PEG6000等，可以有效提高溶劑跨膜通量，改善晶體質(zhì)量，促進晶體成核及生長，得到質(zhì)量更完美的晶體。
　　 對于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶，溶菌酶濃度對溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶過程有重要影響。過高的溶菌酶濃度使得結晶溶液中出現(xiàn)大量粒狀沉淀，晶體質(zhì)量和產(chǎn)率下降，溶劑跨膜通量較低；然而溶菌酶濃度太低，結晶時間較長。一般來說，溶劑跨膜通量隨著蛋白質(zhì)濃度的升高而降低。在研究的

4、溶菌酶濃度范圍內(nèi)，20～30mg/mL，尤其是20mg/mL的溶菌酶濃度，更適合于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶，在此濃度下，能有效控制結晶溶液中晶核的數(shù)量，得到的晶體尺寸較大，并且結晶時間不至太長。
　　 沉淀劑氯化鈉濃度對溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶過程也有重要影響。將沉淀劑濃度從4％提高到6.5％(wt/vol)，結晶誘導時間縮短；進一步升高沉淀劑濃度到9％，則又使得結晶誘導時間延長，溶劑跨膜通量降低。當沉淀劑濃度大于9％時，結晶溶液中

5、出現(xiàn)大量沉淀。對于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶，4～6.5％的沉淀劑濃度是最佳的沉淀劑濃度范圍。對于20mg/mL的溶菌酶，在4％的氯化鈉濃度下，洗脫液氯化鎂濃度和流速分別為25％和4319um/s，結晶溶液的最佳流速為288μm/s。
　　 對于洗脫液濃度和流速對溶菌酶動態(tài)滲透膜結晶的影響，當氯化鎂溶液流速在2880～4319μm/s范圍內(nèi)時，制備了質(zhì)量完美的溶菌酶晶體。對于洗脫液濃度，溶劑跨膜通量隨洗脫液濃度的升高而增長。然而，過

6、高的洗脫液濃度影響最終得到的晶體質(zhì)量，在較高的洗脫液濃度下，晶體數(shù)量增多，但晶體尺寸減小。對于20mg/mL的溶菌酶，在4％的氯化鈉濃度下，洗脫夜流速為4319μm/s，進料液流速為288μm/s時，洗脫液濃度控制在20～25％范圍內(nèi)更適合于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結晶。
　　 對于溶液pH值和離子強度對溶菌酶動態(tài)滲透膜結晶的影響，在相同pH值下，離子強度越高，溶劑跨膜通量越大。晶體的晶形主要受溶液pH值的影響，離子強度則主要影響溶劑

7、跨膜通量。在不同pH值下得到了不同晶形的晶體，提高結晶溶液的pH值，晶體從四角晶系向正交晶系過渡。研究發(fā)現(xiàn)，以pH4.7的醋酸鈉為緩沖溶液時制備了四角晶系和正交晶系的晶體，而以pH6.5和pH8.3的磷酸鹽以及pH8.3的Tris-HCl為緩沖溶液時僅得到正交晶系的晶體。正交晶系的生長速度高于四角晶系。晶體從四角晶系向正交晶系的過渡與溫度以及蛋白質(zhì)濃度有關。另外，晶形也是pH值和沉淀劑濃度的函數(shù)。
　　 對于結晶誘導時間，在4％

8、和6.5％的沉淀劑濃度下，尤其是4％氯化鈉，結晶溶液中的溶菌酶濃度隨著時間的推移而增大；而在9％的氯化鈉下，結晶溶液中的溶菌酶濃度隨著時間的推移而減小。氯化鈉濃度對溶菌酶動態(tài)滲透膜結晶的影響可歸因于對溶菌酶溶解度和溶劑活度雙重作用的結果。其他條件相同時，在研究的氯化鈉濃度范圍內(nèi)(4～9％)，6.5％氯化鈉濃度下的結晶誘導時間最短，4％氯化鈉下的結晶誘導時間最長。
　　 對于木瓜蛋白酶的靜態(tài)滲透膜結晶，硫酸銨和磷酸鈉均可作為結晶過

9、程的優(yōu)良沉淀劑。在17℃時，以pH4.7的醋酸鹽緩沖溶液為溶劑，在這兩種沉淀劑的適當濃度范圍內(nèi)(Na3PO4:4～7％;(NH4)2SO4:4～10％)，均制備了質(zhì)量完美的木瓜蛋白酶晶體。通過監(jiān)控結晶溶液中木瓜蛋白酶濃度隨時間的變化，發(fā)現(xiàn)磷酸鈉為沉淀劑進行木瓜蛋白酶的靜態(tài)滲透膜結晶，在較低木瓜酶濃度下更容易獲得質(zhì)量完美的木瓜蛋白酶晶體。添加劑PEG600和PEG4000的加入，使得木瓜蛋白酶更容易從溶液中結晶出來，誘導時間縮短，形成質(zhì)量

10、更好的木瓜酶晶體。晶體尺寸分布表明，實驗制備的蛋白質(zhì)晶體滿足衍射分析的需要。
　　 此外，還研究了幾種蛋白質(zhì)(卵清蛋白、牛血清白蛋白、脂肪酶)的靜態(tài)滲透膜結晶。對于卵清蛋白的滲透膜結晶，在30mg/mL卵清蛋白濃度下，以pH7.3的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，3～7％的PEG6000為沉淀劑，20％MgCl2為洗脫液，實驗制備了形狀較好，尺寸較大的卵清蛋白晶體；對于牛血清白蛋白的滲透膜結晶，在16～25℃范圍內(nèi)，以pH6.3的磷酸鹽為

11、緩沖溶液時，氯化鈉、PEG600和PEG6000可作為牛血清白蛋白滲透膜結晶的有效沉淀劑。結晶溶液中加入添加劑聚乙二醇類或DMSO可以有效提高溶劑跨膜通量，增大晶體尺寸；對于脂肪酶的滲透膜結晶，以pH6.3的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，硫氰酸鈉、丙三醇、PEG400或PEG600為沉淀劑時，實驗制備了脂肪酶晶體，其中以丙三醇為沉淀劑制備的晶體質(zhì)量最好。
　　 最后，又研究了溶菌酶的真空膜結晶，以pH4.7的醋酸鹽緩沖溶液為溶劑，溶菌酶