殺蟲劑啶蟲脒的微生物代謝與降解研究.pdf

1、本文采用微生物轉化技術對新一代煙堿類殺蟲劑啶蟲脒(acetamiprid，AAP)進行代謝和降解研究。從自然界和菌種庫中篩選到一株 Stenotrophomonasmaltophilia CGMCC 1.1788，采用靜息細胞轉化法，獲得了一種AAP的N脫甲基化產物IM-2.1。殺蟲活性測定結果表明IM-2.1和AAP的作用方式基本相同，具有內吸和觸殺活性，其相對毒力下降至原藥的10％。此外，還篩選到可轉化AAP生成多種產物的真菌菌株R

2、hizopus sp.和 Penicillium sp.X1，通過LC/MS分析，推測了這些產物的分子式，結合已報道的一些關于AAP動植物及土壤中的代謝途徑，推測了AAP在Rhizopus sp.中的代謝途徑。另外，本研究還篩選到了一些對AAP有較強降解作用的菌株，其中一株酵母菌株Rhodotorula mucilaginosaR120天降解率可達91.2％，對AAP殘留物的處理有潛在的應用價值。 以AAP為唯一氮源進行富集培養(yǎng)

3、，從土壤和菌種庫中篩選到8株可將AAP轉化為一種極性更大的化合物的菌株。其中菌種庫中的S.maltophilia CGMCC1.1788菌株具有較高的轉化AAP的能力，轉化樣品經HPLC/MS分析，證明該極性更大的轉化產物為AAP的脫甲基化衍生物。篩選到的其他幾株菌通過16SrDNA結果分析表明，分別為微桿菌(Microbacterium)，短小桿菌(Curtobacterium)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringien

4、sis)和梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformi)。選用S.maltophilia CGMCC 1.1788為進一步研究用菌種。 采用5L發(fā)酵罐進行S. maltophilia CGMCC 1.1788的發(fā)酵和轉化研究，實驗結果表明，轉化96h后，轉化液中轉化產物的含量可達到40mg/L轉化液。采用乙酸乙酯進行萃取，雖然并不能將底物去除，但可有效地去除代謝峰對產物分離的干擾。萃取液經濃縮，有機相濾膜過濾后用TLC薄層

5、分離產物，采用氯仿-甲醇展層劑系統(tǒng)(氯仿：甲醇=9：1)，底物與產物的分離效果最好，洗脫濃縮，有機濾膜過濾，結晶后，可得到純度為96％的產物晶體。晶體經質譜、核磁共振光譜分析，確認其結構為AAP的N脫甲基化的衍生物IM-2.1。 S. maltophilia CGMCC 1.1788菌株在發(fā)酵培養(yǎng)菌體階段，宜取對數生長期中期的細胞進行靜息細胞轉化，以得到較多的IM-2-1。S. maltophilia CGMCC 1.1788菌

6、株轉化0.5％oAAP生成IM-2-1的生長細胞和靜息細胞轉化動力學研究表明其對AAP還有一定的降解作用。在轉化液中添加蔗糖可促進IM-2-1的生成，添加20％的蔗糖，轉化7天IM-2-1的生成較對照組提高了10.7倍。底物AAP在濃度2g/L內對S.maltophilia CGMCC 1.1788脫甲基化酶的活性沒有底物抑制作用，隨著AAP濃度的增加，產物生成量也在不斷增加。在靜息細胞轉化液中添加濃度為0.5和1mmol/L的PBO(

7、細胞色素P450酶的抑制劑)時，脫甲基化活性分別被抑制55％和70％；在細胞培養(yǎng)過程中添加1‰(w/v)的細胞色素P450誘導劑MnCl<,2>，甲苯，丙酮，乙醇和苯巴比妥可提高S.maltophilia CGMCC 1.1788脫甲基化酶的活力，說明S. maltophilia CGMCC 1.1788的脫甲基化酶可能是一種細胞色素P450酶。 AAP及其轉化物：IM-2-1殺蟲活性測定結果表明IM-2-1和AAP的作用方式基

8、本相同，具有內吸和觸殺活性。IM-2-1對蠶豆蚜有殺蟲活性，以AAP的相對毒力為100計，轉化物的觸殺相對毒力僅為10.54，內吸相對毒力僅為13.13，觸殺活性僅為內吸活性的15.87％。這表明在對蚜蟲的防治中AAP的N脫甲基化是一個解毒的過程，因此S. maltophilia將AAP轉化為IM-2-1降低了在土壤中利用AAP的活性。 季氏畢赤酵母Pichia guilliermondii W1和粘質紅酵母Rhodotorul

9、amucilaginosa R1及青霉penicillium sp.X1在添加5％蔗糖的唯一碳源培養(yǎng)基中可降解AAP。培養(yǎng)20天后，P.mucilaginosa R1降解率可達91.2％，Penicillium SP.X1和P.guilliermondii W1分別為80.5％和40.8％。從本研究室保藏的菌種中篩選到一株根霉Rhizopus SP.菌株，通過HPLC分析發(fā)現其靜息細胞轉化可轉化AAP為一系列極性更大的化合物，經LC/M

10、S分析推測它們分別為IM-2-1，IM-1-3，IM-1-4，IM-2-3以及一種尚未報道過的(7-羥基化啶蟲脒)。根據國內外關于AAP在動植物及土壤中代謝途徑的有關報道，推測了AAP在Rhizopus sp.中可能的代謝途徑。 綜上所述，本論文采用微生物轉化法獲得了N-脫甲基啶蟲脒(IM-2-1)，對蚜蟲成蟲生物活性較AAP低一個數量級，表明在對蚜蟲的防治中AAP的N脫甲基化是一個解毒的過程。篩選到一些純培養(yǎng)的真菌具有轉化和降