殺蟲(chóng)劑啶蟲(chóng)脒的微生物代謝與降解研究.pdf

1、本文采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)新一代煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑啶蟲(chóng)脒(acetamiprid，AAP)進(jìn)行代謝和降解研究。從自然界和菌種庫(kù)中篩選到一株 Stenotrophomonasmaltophilia CGMCC 1.1788，采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，獲得了一種AAP的N脫甲基化產(chǎn)物IM-2.1。殺蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果表明IM-2.1和AAP的作用方式基本相同，具有內(nèi)吸和觸殺活性，其相對(duì)毒力下降至原藥的10％。此外，還篩選到可轉(zhuǎn)化AAP生成多種產(chǎn)物的真菌菌株R

2、hizopus sp.和 Penicillium sp.X1，通過(guò)LC/MS分析，推測(cè)了這些產(chǎn)物的分子式，結(jié)合已報(bào)道的一些關(guān)于AAP動(dòng)植物及土壤中的代謝途徑，推測(cè)了AAP在Rhizopus sp.中的代謝途徑。另外，本研究還篩選到了一些對(duì)AAP有較強(qiáng)降解作用的菌株，其中一株酵母菌株Rhodotorula mucilaginosaR120天降解率可達(dá)91.2％，對(duì)AAP殘留物的處理有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 以AAP為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng)

3、，從土壤和菌種庫(kù)中篩選到8株可將AAP轉(zhuǎn)化為一種極性更大的化合物的菌株。其中菌種庫(kù)中的S.maltophilia CGMCC1.1788菌株具有較高的轉(zhuǎn)化AAP的能力，轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)HPLC/MS分析，證明該極性更大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為AAP的脫甲基化衍生物。篩選到的其他幾株菌通過(guò)16SrDNA結(jié)果分析表明，分別為微桿菌(Microbacterium)，短小桿菌(Curtobacterium)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringien

4、sis)和梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformi)。選用S.maltophilia CGMCC 1.1788為進(jìn)一步研究用菌種。 采用5L發(fā)酵罐進(jìn)行S. maltophilia CGMCC 1.1788的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化96h后，轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量可達(dá)到40mg/L轉(zhuǎn)化液。采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，雖然并不能將底物去除，但可有效地去除代謝峰對(duì)產(chǎn)物分離的干擾。萃取液經(jīng)濃縮，有機(jī)相濾膜過(guò)濾后用TLC薄層

5、分離產(chǎn)物，采用氯仿-甲醇展層劑系統(tǒng)(氯仿：甲醇=9：1)，底物與產(chǎn)物的分離效果最好，洗脫濃縮，有機(jī)濾膜過(guò)濾，結(jié)晶后，可得到純度為96％的產(chǎn)物晶體。晶體經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振光譜分析，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)為AAP的N脫甲基化的衍生物IM-2.1。 S. maltophilia CGMCC 1.1788菌株在發(fā)酵培養(yǎng)菌體階段，宜取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的細(xì)胞進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以得到較多的IM-2-1。S. maltophilia CGMCC 1.1788菌

6、株轉(zhuǎn)化0.5％oAAP生成IM-2-1的生長(zhǎng)細(xì)胞和靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)研究表明其對(duì)AAP還有一定的降解作用。在轉(zhuǎn)化液中添加蔗糖可促進(jìn)IM-2-1的生成，添加20％的蔗糖，轉(zhuǎn)化7天IM-2-1的生成較對(duì)照組提高了10.7倍。底物AAP在濃度2g/L內(nèi)對(duì)S.maltophilia CGMCC 1.1788脫甲基化酶的活性沒(méi)有底物抑制作用，隨著AAP濃度的增加，產(chǎn)物生成量也在不斷增加。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中添加濃度為0.5和1mmol/L的PBO(

7、細(xì)胞色素P450酶的抑制劑)時(shí)，脫甲基化活性分別被抑制55％和70％；在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加1‰(w/v)的細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)劑MnCl<,2>，甲苯，丙酮，乙醇和苯巴比妥可提高S.maltophilia CGMCC 1.1788脫甲基化酶的活力，說(shuō)明S. maltophilia CGMCC 1.1788的脫甲基化酶可能是一種細(xì)胞色素P450酶。 AAP及其轉(zhuǎn)化物：IM-2-1殺蟲(chóng)活性測(cè)定結(jié)果表明IM-2-1和AAP的作用方式基

8、本相同，具有內(nèi)吸和觸殺活性。IM-2-1對(duì)蠶豆蚜有殺蟲(chóng)活性，以AAP的相對(duì)毒力為100計(jì)，轉(zhuǎn)化物的觸殺相對(duì)毒力僅為10.54，內(nèi)吸相對(duì)毒力僅為13.13，觸殺活性僅為內(nèi)吸活性的15.87％。這表明在對(duì)蚜蟲(chóng)的防治中AAP的N脫甲基化是一個(gè)解毒的過(guò)程，因此S. maltophilia將AAP轉(zhuǎn)化為IM-2-1降低了在土壤中利用AAP的活性。 季氏畢赤酵母Pichia guilliermondii W1和粘質(zhì)紅酵母Rhodotorul

9、amucilaginosa R1及青霉penicillium sp.X1在添加5％蔗糖的唯一碳源培養(yǎng)基中可降解AAP。培養(yǎng)20天后，P.mucilaginosa R1降解率可達(dá)91.2％，Penicillium SP.X1和P.guilliermondii W1分別為80.5％和40.8％。從本研究室保藏的菌種中篩選到一株根霉Rhizopus SP.菌株，通過(guò)HPLC分析發(fā)現(xiàn)其靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化可轉(zhuǎn)化AAP為一系列極性更大的化合物，經(jīng)LC/M

10、S分析推測(cè)它們分別為IM-2-1，IM-1-3，IM-1-4，IM-2-3以及一種尚未報(bào)道過(guò)的(7-羥基化啶蟲(chóng)脒)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外關(guān)于AAP在動(dòng)植物及土壤中代謝途徑的有關(guān)報(bào)道，推測(cè)了AAP在Rhizopus sp.中可能的代謝途徑。 綜上所述，本論文采用微生物轉(zhuǎn)化法獲得了N-脫甲基啶蟲(chóng)脒(IM-2-1)，對(duì)蚜蟲(chóng)成蟲(chóng)生物活性較AAP低一個(gè)數(shù)量級(jí)，表明在對(duì)蚜蟲(chóng)的防治中AAP的N脫甲基化是一個(gè)解毒的過(guò)程。篩選到一些純培養(yǎng)的真菌具有轉(zhuǎn)化和降