殺蟲劑吡蟲啉的微生物轉(zhuǎn)化研究——微生物轉(zhuǎn)化法制備殺蟲劑吡蟲啉衍生物及活性研究.pdf

1、生物催化和轉(zhuǎn)化技術(shù)因其高效性、多樣性、底物專一性、區(qū)域選擇性、化學選擇性、對映選擇性以及溫和的反應(yīng)條件等特點，被譽為繼醫(yī)藥生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)之后的“第三次生物技術(shù)浪潮”。本文采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進行新農(nóng)藥的創(chuàng)制。選擇了高效，對溫血動物低毒的煙堿類殺蟲劑吡蟲啉(imidaeloprid，IMI)為底物，從自然界和菌種庫中篩選可轉(zhuǎn)化IMI的菌株，采用靜息細胞轉(zhuǎn)化法羥基化IMI，獲得了一種IMI羥基化的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-羥基吡蟲啉(5-hydro

2、xy IMI)，5-hydroxy IMI經(jīng)酸、熱水解可得到文獻報道的殺蟲活性提高10-16倍的烯式毗蟲啉(olefin IMI)。 以IMI為唯一氮源進行富集培養(yǎng)，從土壤中篩選到了7株可將IMI轉(zhuǎn)化為一種極性更大的化合物的菌株。其中一株命名為NJl的菌株具有較高的轉(zhuǎn)化IMI的能力，轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)HPLC／MS分析，證明該極性更大的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為IMI的羥基化衍生物。采用BioMerieux Vitek自動微生物分析儀鑒定，NJl菌株

3、被鑒定為Stenotrophomonasmaltophilia；16S rDNA結(jié)果分析進一步證明了NJl菌株與在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于S. maltophilia。從菌種庫中篩選結(jié)果表明，與NJl菌株屬于同一個種的S.maltophiliaCGMCC 1.1788菌株的轉(zhuǎn)化能力高于NJl菌株。S.maltophilia CGMCCl.1788被選為進一步研究用菌種。 S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株發(fā)酵條

4、件研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度介于20至35℃之間，羥基化酶活性幾乎沒有變化，而最適生長溫度為30℃；最高羥基化酶活性出現(xiàn)在對數(shù)生長期中期之后；蘋果酸和麥芽糖為最適生長碳源，琥珀酸和乙酸鈉為羥基化酶活性碳源，乙酸鈉為最適比酶活力碳源；牛肉膏為最適生長氮源，酵母膏和玉米漿分別為最適羥基化酶活性和比酶活力氮源；各種吡啶類化合物和咪唑烷類化合物作為誘導劑添加到培養(yǎng)基中，測試結(jié)果表明酶形成不需要誘導劑誘導。 5．hydroxy IMI合成條

5、件研究結(jié)果表明，酶活性受通氣量影響較大，搖瓶裝液量越少，酶活性越大，搖瓶轉(zhuǎn)速越高，轉(zhuǎn)化活力越高；最適轉(zhuǎn)化溫度為25℃；在轉(zhuǎn)化液中添加蔗糖、葡萄糖和蘋果酸等促進劑可顯著提高酶活性，添加5％(w／v)蔗糖的轉(zhuǎn)活性較對照組提高了近9倍；最適羥基化酶活性pH為6.5；底物最適濃度為0.01％。 采用5L發(fā)酵罐進行S.maltophilia CGMCC 1.1788的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化研究，實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化70h后，轉(zhuǎn)化液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量可達

6、到260rag／L轉(zhuǎn)化液。采用二氯甲烷萃取兩次后，約97％的未轉(zhuǎn)化的底物被去除，93％的產(chǎn)物仍保留在水相中；含有轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取，87％的產(chǎn)物可被萃取到乙酸乙酯相中。萃取液經(jīng)濃縮，有機相膜過濾，結(jié)晶后，可得到純度為98％的產(chǎn)物晶體。晶體經(jīng)質(zhì)譜、元素分析、核磁共振光譜和單晶體x一射線衍射法分析，確認其結(jié)構(gòu)為5.hydroxy IMI，且羥基所在的碳原子具有順式構(gòu)。 采用酸熱水解法將5-hydroxy I

7、MI轉(zhuǎn)變成olefin IMI實驗結(jié)果表明，0.1M鹽酸、80℃加熱25 min后，5-hydroxy IMI可完全被水解；酸熱水解產(chǎn)物經(jīng)HPLC／MS和NMR分析確認為olefin IMI。5-hydroxy IMI轉(zhuǎn)變?yōu)閛lefin IMI的摩爾轉(zhuǎn)變系數(shù)為86.97％。生物活性測試結(jié)果表明，olefin IMI和5-hydroxy IMI均有殺蠶豆蚜活性。經(jīng)以IMI為對照，三者的殺蟲活性排序為olefin IMI>IMI>5-hyd

8、roxy IMI。相對毒力指數(shù)測定表明，olefin IMI對蠶豆蚜成蟲的活性是IMI的19倍，是蠶豆蚜若蚜的2.25倍，olefin IMI對褐飛虱成蟲的活性是IMI的1.43倍，但對褐飛虱若蟲的活性只有IMI的0.5倍。盆栽試驗驗證了室內(nèi)生物活性結(jié)果，并證明olefin IMI對蠶豆苗安全。 綜上所述，本論文采用微生物轉(zhuǎn)化法獲得了5-hydroxy IMI，5-hydroxy IMI經(jīng)酸水解后得到了對蚜蟲成蟲生物活性高于I