實驗動物皮膚病原真菌分子生物學檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、No20032323河暗蓮科六蠆碩士研究生畢業(yè)論文實驗動物皮膚病原真菌分子生物學檢測方法的建立及應(yīng)用研究生導師專業(yè)二級學院研究起止日期提交同期龔巧玲劉福英教授劉軍須副教授生物化學與分子生物學基礎(chǔ)醫(yī)學院2004年9月一2006年3月2006年3月中文摘要養(yǎng)物，接種于沙氏液體培養(yǎng)基，置27℃恒溫搖床80轉(zhuǎn)／分振蕩培養(yǎng)10天。將培養(yǎng)液倒入100ml離心管內(nèi)離心，沉淀裝入15mlEp管中，70℃或液氮保存。取以上冷凍保存的三種菌沉淀物少量(各約

2、1Omg)用破壁酶破壁，使用酚氯仿抽提法抽提DNA；然后用皮膚病原真菌通用引物(CHS11S，CHS11R)和隨機引物(FMl)進行PCR擴增，鑒別三種皮膚真菌標準菌株。2通用引物PCR特異性及敏感性測定特異性測定：用皮膚病原真菌通用引物進行PCR，擴增大腸桿菌DNA(化學裂解法提取)、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22細胞DNA(由本室提供)。敏感性測定：DNA提取方法同上，以紫外分光光度法測定DNA質(zhì)量濃度，根據(jù)測定值將DNA進行1O

3、倍系列質(zhì)量濃度稀釋，得到100ng一10龜?shù)?個質(zhì)量濃度，然后對其進行PCR擴增。3皮膚病原真菌動物模型的建立：取三種標準菌株傳種到沙氏斜面固體培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)1O天。取下菌落加適量滅菌生理鹽水制成菌懸液，用劃痕法建立實驗動物皮膚病原真菌動物模型。4使用分子生物學方法及傳統(tǒng)方法檢測皮膚病原真菌：用接種鏟從建立的動物模型身上刮取毛發(fā)及鱗屑于沙氏斜面固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3天后菌落長出，從培養(yǎng)基上刮取菌落提取DNA及用通用引物PCR擴增鑒