MTs調(diào)控參環(huán)毛蚓重金屬富集機制及其平喘作用的研究.pdf

1、目的:
　　參環(huán)毛蚓的藥材習(xí)稱為“廣地龍”，是國內(nèi)外藥材市場中公認的地龍優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。然而廣地龍重金屬超標問題一直制約其進一步發(fā)展。本團隊通過實驗研究，發(fā)現(xiàn)藥材重金屬超標與其動物所具有的重金屬富集和耐受生理特性有直接關(guān)系，并且已確認重金屬富集作用與金屬硫蛋白(MTs)相關(guān)。但是，更深層次地解釋參環(huán)毛蚓重金屬富集現(xiàn)象如何產(chǎn)生？其調(diào)控機制如何？在不影響已有藥效的前題下，如何從源頭上控制藥材重金屬超標等問題一直未能解決。本文試圖從MTs入手

2、，系統(tǒng)闡明MTs在調(diào)控參環(huán)毛蚓重金屬富集中的作用，明確其重金屬調(diào)控機理，同時通過動物實驗考察MTs對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的影響，為揭示參環(huán)毛蚓重金屬富集特性的分子生物學(xué)機制奠定基礎(chǔ)，也為進一步制定解除廣地龍藥材重金屬富集策略，保證其藥材安全有效提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用劃線法活化含有pET-32a(+)-MT-2重組質(zhì)粒及pET-32a(+)對照質(zhì)粒保存菌株，IPTG誘導(dǎo)其表達，使用SDS-PAGE和Wes

3、tern Blot檢測及確認其表達情況。
　　2.不同濃度重金屬鎘脅迫處理表達重組MT-2基因菌株，分別采用平板涂布觀察法及原子吸收法考察其提高重金屬耐受及富集特性。
　　3.將MT-2重組轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，離心獲得菌體，再經(jīng)超聲和溶菌酶破菌后SDS-PAGE分析其表達形式，并利用Ni柱純化試劑盒對目的蛋白進行純化，同時體外建立自由基損傷DNA模型，通過瓊脂糖電泳考察純化MT-2重組蛋白抗氧化損傷的能力。
　

4、　4.結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中有關(guān)蚯蚓Actin序列，設(shè)計引物，通過PCR擴增，擴增產(chǎn)物交由華大基因生物公司測序，Blast相似性搜索驗證擴增和測序結(jié)果的準確性。根據(jù)獲知內(nèi)參Actin基因及MT-2 cDNA序列設(shè)計引物，通過熒光定量PCR研究不同濃度重金屬脅迫處理下參環(huán)毛蚓體內(nèi)MT-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　5.根據(jù)已知的MT-2 cDNA序列，設(shè)計特異引物，通過PCR擴增MT-2基因的編碼區(qū)序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后自行

5、比對分析。基于該序列設(shè)計3條特異引物，采用基因步移技術(shù)克隆其上游的啟動子序列，同時運用Promoter Prediction在線軟件分析預(yù)測其順式元件。
　　6.采用BALB/c哮喘小鼠模型，使用全身體積掃描系統(tǒng)進行氣道反應(yīng)性測定，取其肺部組織病理組織切片進行HE、PAS染色，用臺盼藍染色法對其細胞灌洗液(BALF)中總細胞數(shù)計數(shù)，同時使用ELISA分別檢測小鼠血清中的IgE以及BALF中IL4、IL5、IL13的水平。
　

6、　結(jié)果:
　　1.SDS-PAGE電泳表明重組MT-2蛋白成功表達，Western blot證實了表達產(chǎn)物的正確性，表明MT-2重組菌株可用于后續(xù)實驗。
　　2.重金屬耐受性實驗表明，表達MT-2重組蛋白的菌株耐鎘的能力明顯高于空白對照菌，且鎘的最高耐受劑量可達250μM。重金屬富集實驗表明，較空白對照菌，表達MT-2重組蛋白的菌株重金屬富集能力顯著增強。在低劑量組鎘離子(10μM和20μ M)處理下，MT-2重組菌吸附重金

7、屬的含量分別為對照菌的1.9和8.8倍;而在高劑量組鎘離子（250μ M和500μM）處理下，MT-2重組菌吸附重金屬的含量分別為對照菌的4.4和8.3倍。結(jié)果表明，金屬硫蛋白在抗重金屬毒害、重金屬富集方面具有重要作用。
　　3.SDS-PAGE分析，MT-2重組蛋白的表達形式有可溶和不可溶兩種形式，主要以可溶形式為主。將收集菌體裂解上清液經(jīng)Ni純化試劑盒可獲得純度較高的MT-2重組蛋白。體外瓊脂糖凝膠電泳顯示，MT-2重組蛋白可

8、明顯保護自由基引起的DNA損傷，且與其劑量呈正相關(guān)。
　　4.經(jīng)PCR擴增、測序后獲得參環(huán)毛蚓Actin部分cDNA序列，再經(jīng)Blast相似性搜索，結(jié)果表明Actin基因片段的擴增和測序結(jié)果準確和可靠性，可用于參環(huán)毛蚓定量PCR的研究。MT-2基因?qū)崟r定量PCR結(jié)果表明，重金屬鎘可顯著誘導(dǎo)MT-2 mRNA的表達，表達水平呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。鎘誘導(dǎo)3天時，mRNA的表達已顯著升高，經(jīng)鎘誘導(dǎo)7天時，其表達水平達到最高。
　

9、　5.經(jīng)PCR擴增、測序后獲得2826 bpMT-2基因編碼區(qū)序列，將該序列與已知的MT-2cDNA序列（登錄號為KC787373.1）進行比對，發(fā)現(xiàn)MT-2編碼區(qū)由4個外顯子和4個內(nèi)含子組成?；虿揭萍夹g(shù)克隆得到1534bp的啟動子序列，經(jīng)Promoter Prediction在線軟件分析，結(jié)果顯示該序列不僅含有TATA-box、CAAT-box等核心啟動子軟件，還具有3個參與調(diào)控MT-2表達的特異響應(yīng)重金屬MRE元件。
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10、.對小鼠氣道阻力值的測定發(fā)現(xiàn)，生理鹽水和不同濃度的乙酰甲膽堿激發(fā)后，哮喘模型組小鼠氣道阻力顯著高于空白組(p＜0.01)，而MTs組與模型組比無明顯變化，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);模型組小鼠BALF中總細胞高于空白組(p＜0.01)，MTs組與模型組比總細胞數(shù)無明顯下降，無統(tǒng)計學(xué)意義;模型組血清IgE和BALF中IL4、IL5及IL13的水平明顯高于空白組(p＜0.01)，MTs與模型組比，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論: