Profilin-1在自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大的定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　研究背景:
　　心肌肥大是心肌細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)對血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷和神經(jīng)體液失調(diào)等多種病理刺激的基本應(yīng)答和代償反應(yīng)，是許多心血管疾?。ㄈ绺哐獕骸⑿呐K瓣膜病、急性心肌梗塞和先天性心臟?。┌l(fā)生發(fā)展過程中共有的病理變化。臨床流行病學(xué)資料顯示，心肌肥大導(dǎo)致心源性猝死和心力衰竭的發(fā)病率明顯增高，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，已被列為影響心血管疾病發(fā)病率和死亡率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。因此，對

2、心肌肥大發(fā)生機(jī)制的探討并尋找有效的預(yù)防和治療措施，具有十分深遠(yuǎn)的臨床意義和科研價(jià)值。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，探究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)，在細(xì)胞和生命有機(jī)體的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律。同位素標(biāo)記的相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是近年來開發(fā)的一種新的比較蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù)。iTR

3、AQ技術(shù)可對一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定，尋找差異表達(dá)蛋白，并分析其蛋白功能。與傳統(tǒng)的依賴凝膠電泳的定量技術(shù)相比，iTRAQ是基于高度敏感性和精確性的串聯(lián)質(zhì)譜方法;可同時(shí)對4種甚至8種不同來源的樣品進(jìn)行絕對和相對定量研究;不僅可以發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還可發(fā)現(xiàn)膜蛋白、核蛋白甚至胞外蛋白;可以檢測出低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、小于10kD或大于200kD的蛋白。iTRAQ技術(shù)的發(fā)展為探討心肌肥大的發(fā)生機(jī)制，尋找關(guān)鍵的作用蛋白提供了高效

4、可靠的研究方法。
　　自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous Hypertension Rat，SHR)是1959年由日本京都大學(xué)Okamoto和Aoki培育而成的遺傳性高血壓動(dòng)物模型。SHR在遺傳特性、發(fā)病機(jī)制以及高血壓心血管并發(fā)癥等方面均與人類原發(fā)性高血壓十分相似，是目前國際公認(rèn)最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型。心肌肥大是SHR重要特征之一，高血壓性心肌肥大在幼年SHR已出現(xiàn)，并存在于高血壓整個(gè)自然病程中。
　　因此

5、，本研究選用特定年齡階段的SHR大鼠為研究對象，采用定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)，著力于發(fā)現(xiàn)SHR大鼠早期心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中差異表達(dá)的功能性蛋白或蛋白群，并利用生物信息學(xué)方法分析差異蛋白的分子功能、蛋白分類及生物學(xué)過程，篩選并鑒定在高血壓性心肌肥大發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的蛋白分子，為高血壓心肌肥大的防治提供有效靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　1.研究自發(fā)性高血壓大鼠心肌病變的特點(diǎn)，觀察5周齡和17周齡SHR大鼠心肌組織的病

6、理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化;
　　2.應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究SHR大鼠肥大心肌與同周齡WKY大鼠正常心肌組織的差異表達(dá)蛋白，從整體水平上揭示高血壓心肌肥大病變的病理生理機(jī)制，并篩選關(guān)鍵靶蛋白;
　　研究方法:
　　4周齡雄性SHR大鼠8只，WKY大鼠8只，16周齡雄性SHR大鼠8只，WKY大鼠8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后（即5周齡和17周齡時(shí)）進(jìn)入實(shí)驗(yàn):
　　1.大鼠尾動(dòng)脈收縮壓測定:處死前通過無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)檢測各

7、組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓;
　　2.心臟質(zhì)量指數(shù)測定:大鼠處死后，稱量心臟重和左室重，測量主動(dòng)脈瓣至心尖的距離為左心室長軸。以左室重/心臟重和左心室長軸作為反應(yīng)心室肥大的指標(biāo);
　　3.心肌組織病理學(xué)檢測:HE染色觀察心肌組織病理變化，天狼星紅染色測定膠原纖維面積百分比;
　　4.心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡技術(shù)觀察心肌肌絲、肌節(jié)、線粒體及細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);
　　5.蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)分析:5周齡WKY大鼠（

8、WKY-5）、5周齡SHR大鼠（SHR-5）、17周齡WKY大鼠（WKY-17）和17周齡SHR大鼠（SHR-17）各8只，提取左心室總蛋白。采用胰酶消化蛋白得到肽段，按照ABI公司說明書操作標(biāo)記肽段，114標(biāo)記WKY-5組，115標(biāo)記SHR-5組，116標(biāo)記WKY-17組，117標(biāo)記SHR-17組。將各組已標(biāo)記的肽段混合后用強(qiáng)陽離子交換柱和C18柱進(jìn)行分離，然后采用MALDI-TOF/TOF和MicroQ-TOF進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。不同報(bào)告

9、基團(tuán)離子的強(qiáng)度代表其所標(biāo)記的多肽的相對豐度;
　　6.差異蛋白質(zhì)功能分析:利用Data Analysis4.0軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用Mascot軟件搜索與質(zhì)譜匹配的蛋白。采用 Panther軟件(http://www.pantherdb.org/)對差異蛋白進(jìn)行GO分析，包括分子功能，生物過程和細(xì)胞組成三個(gè)部分;
　　7.驗(yàn)證profilin-1的表達(dá):采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)技術(shù)檢測各組大鼠心肌組織中profil

10、in-1的mRNA水平，蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Western blot)檢測profilin-1的蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的可靠性。
　　研究結(jié)果:
　　1.大鼠尾動(dòng)脈收縮壓:5周齡WKY大鼠收縮壓為111.2±7.6mmHg，5周齡SHR大鼠收縮壓為143.1±10.5mmHg，已顯著升高(P＜0.001)，17周齡WKY大鼠收縮壓為117.7±8.6mmHg，17周齡SHR大鼠收縮壓為216.3±12.1mmHg，收

11、縮壓的差異更為顯著(P＜0.001)。
　　2.大鼠心臟肥大指數(shù):5周齡SHR大鼠的平均LVW/HW比值為0.55±0.02，5周齡WKY大鼠的平均LVW/HW比值為0.54±0.02，兩者無顯著差異;17周齡SHR大鼠的平均LVW/HW比值為0.77±0.06，同周齡WKY大鼠的平均LVW/HW比值為0.60±0.03，SHR大鼠較WKY大鼠升高28.33％。5周齡SHR大鼠的左室長軸平均長度為6.45±0.33mm，同周齡WK

12、Y大鼠的左室長軸平均長度為6.42±0.36mm，兩者無顯著差異;17周齡SHR大鼠的左室長軸平均長度為13.31±0.67mm，同周齡WKY大鼠的左室長軸平均長度為9.97±0.60mm，SHR大鼠較WKY大鼠升高33.50％。
　　3.大鼠心肌病理學(xué)分析
　　3.1、心肌HE染色:5周齡及17周齡的WKY大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊、致密，肌纖維無斷裂，橫紋、閏盤及細(xì)胞核染色清晰;5周齡SHR大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及排

13、列基本正常;17周齡SHR大鼠心肌細(xì)胞腫脹、內(nèi)容物成顆粒狀，部分細(xì)胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，多數(shù)橫紋、閏盤尚清晰，細(xì)胞核肥大或固縮，個(gè)別視野心肌間質(zhì)纖維化;橫截面上可見心肌細(xì)胞直徑增寬，單個(gè)心肌細(xì)胞面積明顯增加。
　　3.2、心肌天狼星紅染色:WKY大鼠心肌間質(zhì)幾乎無膠原纖維分布，對40個(gè)隨機(jī)視野分析后得到其天狼星紅染色陽性區(qū)域約占視野下總面積的0.13±0.01％(5周齡)和0.18±0.02％（1

14、7周齡）;5周齡SHR大鼠心肌膠原纖維占視野下總面積的0.15±0.01％，與同周齡WKY大鼠相比無顯著差異;17周齡SHR大鼠心肌膠原分布較同周齡WKY大鼠明顯增多，約占總面積的2.93±0.26％(P＜0.001)。
　　4.大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察:電鏡下可見5周齡和17周齡WKY大鼠心肌組織中，肌原纖維含量豐富，排列規(guī)整，Z線和明暗帶清晰;閏盤結(jié)構(gòu)正常;線粒體沿肌原纖維長軸平行排列，可見均勻的基質(zhì)顆粒和完整致密的線粒體嵴;細(xì)胞

15、核為圓形或橢圓形，核染色質(zhì)均勻，核仁清晰，核膜平滑完整。5周齡SHR大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)尚未出現(xiàn)典型的心肌肥大表現(xiàn)，但肌原纖維排列已出現(xiàn)紊亂，部分區(qū)域肌絲溶解，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，Z線斷裂成波浪狀;線粒體數(shù)量略增多，排布出現(xiàn)不規(guī)整;細(xì)胞核及其他細(xì)胞器形態(tài)基本正常。17周齡SHR大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列紊亂，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，Z線斷裂成波浪狀，部分區(qū)域肌絲溶解消失而被增生的線粒體取代;線粒體形態(tài)異常，數(shù)量增多且排布紊亂，部分線粒體腫脹，因基質(zhì)

16、顆粒的缺失出現(xiàn)了電子透亮區(qū)，線粒體嵴模糊不清;細(xì)胞核肥大、畸形，核膜呈不規(guī)則凹陷，染色質(zhì)聚集成小團(tuán)塊，在核膜內(nèi)側(cè)尤為顯著，核仁較為明顯;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá)，提示合成分泌功能旺盛，符合心肌肥厚表現(xiàn)。
　　5.質(zhì)譜分析結(jié)果:實(shí)驗(yàn)共鑒定出大鼠心肌蛋白506個(gè)，5周齡SHR大鼠與WKY大鼠相比差異表達(dá)蛋白共7個(gè)，其中上調(diào)3個(gè)，下調(diào)4個(gè);17周齡SHR大鼠與WKY大鼠相比差異表達(dá)蛋白28個(gè)，其中上調(diào)17個(gè)，下調(diào)11個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，

17、5周齡和17周齡WKY與SHR兩組中共同的差異蛋白有3個(gè)，分別是:Profilin-1、Myosin light chain kinase 2和Mitochondrial NADP+-isocitrate dehydrogenase。
　　6.SHR大鼠肥大心肌差異蛋白的功能分析:根據(jù)分子功能注釋，差異蛋白主要執(zhí)行結(jié)構(gòu)性分子功能(36.7％)，結(jié)合功能(30.0％)和催化功能(20.0％)。根據(jù)生物過程注釋，差異蛋白主要參與細(xì)胞過

18、程(18.0％)、代謝過程(16.0％)、生長發(fā)育(14.0％)及生物合成(14.0％)4種生物過程。根據(jù)細(xì)胞成分注釋，主要包含細(xì)胞組成(47.6％)、細(xì)胞器(42.9％)、細(xì)胞膜(4.8％)及細(xì)胞連接(4.8％)四部分。Panther蛋白種類分析顯示差異蛋白主要包含細(xì)胞骨架蛋白(33.3％)、酶調(diào)節(jié)蛋白(13.3％)、結(jié)構(gòu)蛋白(10.0％)和氧化還原蛋白(6.7％)等，細(xì)胞骨架蛋白占據(jù)的高比例（三分之一）與前面結(jié)構(gòu)性分子功能(36.7

19、％)相呼應(yīng)，可見細(xì)胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理過程中占據(jù)重要地位。
　　7.實(shí)時(shí)定量PCR檢測Profilin-1的mRNA表達(dá):5周齡SHR大鼠profilin-1mRNA表達(dá)水平為同周齡WKY大鼠的1.86倍，表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.001);17周齡SHR大鼠profilin-1mRNA表達(dá)水平為同周齡WKY大鼠的2.83倍，表達(dá)上調(diào)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與iTRAQ研究結(jié)果一致。

20、r>　　8.Western Blot檢測Profilin-1的蛋白表達(dá):與同周齡WKY大鼠相比，5周齡SHR大鼠心肌組織profilin-1的蛋白水平上調(diào)了約23.33％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);17周齡SHR大鼠心肌組織profilin-1的蛋白水平較同周齡WKY大鼠上調(diào)了約64.10％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Westem-blot結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.心臟質(zhì)量指

21、數(shù)、心肌病理學(xué)分析以及超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果均證實(shí)17周齡SHR大鼠心肌肥大模型已構(gòu)建成功，5周齡SHR大鼠心肌出現(xiàn)早期病理改變，尚未發(fā)生心肌肥大。
　　2.作為定量比較蛋白質(zhì)組學(xué)的新技術(shù)iTRAQ具有較好的精確性、重復(fù)性和定量效果，可用于研究SHR大鼠心肌肥大的分子機(jī)制，找到該發(fā)病過程的關(guān)鍵蛋白及通路。
　　3.質(zhì)譜鑒定17周齡SHR大鼠肥大心肌與同周齡WKY大鼠正常心肌的差異表達(dá)蛋白28個(gè)，其中上調(diào)17個(gè)，下調(diào)11個(gè)，經(jīng)GO分

22、析后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白在SHR大鼠心肌肥大病理過程中占據(jù)重要地位。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)SHR大鼠心肌組織中profilin-1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，這一方面驗(yàn)證了iTRAQ技術(shù)的可靠性，同時(shí)為深入研究高血壓誘導(dǎo)的心肌肥大的發(fā)病機(jī)制提供了關(guān)鍵的候選靶點(diǎn)。
　　第二部分：profilin-1在高血壓大鼠心肌肥大中的作用及機(jī)制研究
　　研究背景：
　　高血壓是心肌肥大的首要致病因

23、素，患者的心臟處于血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷狀態(tài)時(shí)，心肌細(xì)胞可感知該種牽張刺激，產(chǎn)生、釋放多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與心肌細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后激活多種肥大相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，隨后誘導(dǎo)核內(nèi)原癌基因的轉(zhuǎn)錄活化，啟動(dòng)心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)過程。胞膜的功能蛋白、細(xì)胞骨架系統(tǒng)和細(xì)胞因子間的相互作用共同參與了這一病理生理過程，其中細(xì)胞骨架系統(tǒng)是感知力學(xué)刺激、將機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)的關(guān)鍵組件，研究細(xì)胞骨架，尤其是肌動(dòng)蛋白微絲系統(tǒng)，是深入認(rèn)識(shí)血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷誘導(dǎo)

24、下心肌肥大發(fā)生機(jī)制的重要切入點(diǎn)。
　　Profilin-1是一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可受細(xì)胞外信號(hào)影響而調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)組裝。課題組前期研究提示profilin-1在哇巴因高血壓大鼠心肌肥大早期發(fā)揮關(guān)鍵作用，且第一部分的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果揭示自發(fā)性高血壓大鼠早期肥大心肌中profilin-1的表達(dá)較對照組顯著升高。因此，本課題將利用自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大模型，構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中profilin-1基因的

25、過表達(dá)和沉默，綜合運(yùn)用各種病理學(xué)組織學(xué)染色技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)研究profilin-1在高血壓心肌肥厚病變發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機(jī)制。這些結(jié)果將為高血壓心肌肥大患者的早期防治提供新靶點(diǎn)，具有重要的學(xué)術(shù)理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　研究目的：
　　1.自發(fā)性高血壓心肌肥大模型大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染高表達(dá)腺病毒載體pAd-profilin-1-IRES-EGFP或干擾腺病毒載體pAd-miR-profilin-1，觀察對心肌肥大病

26、變的影響;
　　2.在組織病理學(xué)水平、細(xì)胞分子水平和超微結(jié)構(gòu)水平研究profilin-1參與高血壓心肌肥大發(fā)生發(fā)展的機(jī)制;
　　研究方法：
　　1.5周齡自發(fā)性高血壓大鼠60只，隨機(jī)分為SHR-C組、SHR-I組和SHR-H組;5周齡健康WKY大鼠20只作為對照組WKY-C組。SHR-C組與WKY-C組大鼠經(jīng)尾靜脈注射陰性對照腺病毒載體3×109PFU/只，SHR-I組大鼠經(jīng)尾靜脈注射干擾腺病毒載體pAd-miR-pr

27、ofilin-13×109PFU/只，SHR-H組大鼠經(jīng)尾靜脈注射高表達(dá)腺病毒載體pAd-profilin-1-IRES-EGFP3×109PFU/只。6周后補(bǔ)充注射一次，劑量同第一次，第二次腺病毒注射6周后處死動(dòng)物留取標(biāo)本;
　　2.大鼠尾動(dòng)脈收縮壓監(jiān)測:實(shí)驗(yàn)開始前（5周齡）及腺病毒轉(zhuǎn)染后每周末通過大鼠尾動(dòng)脈血壓測量儀監(jiān)測大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，觀察profilin-1過表達(dá)和沉默后對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響;
　　3.心臟質(zhì)

28、量指數(shù)測定:大鼠處死后，稱量心臟重和左室重，測量主動(dòng)脈瓣至心尖的距離為左心室長軸。左室與心臟的重量比和左心室長軸均可作為反應(yīng)心室肥大的指標(biāo);
　　4.腺病毒轉(zhuǎn)染效率檢測:第二次注射腺病毒后10天，取心肌標(biāo)本切冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光并拍照，利用Image-ProPlus6.0軟件檢測每個(gè)視野下EGFP綠色熒光細(xì)胞占所有心肌細(xì)胞的比例，該比值反應(yīng)腺病毒轉(zhuǎn)染效率;
　　5.病理學(xué)檢測:對大鼠心肌組織分別進(jìn)行HE

29、染色和天狼星紅染色，觀察腺病毒轉(zhuǎn)染后各組大鼠心肌組織病理改變;
　　6.心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡技術(shù)觀察心肌肌絲、肌節(jié)、線粒體及小窩等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);
　　7.免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察profilin-1在心肌中的定位，免疫熒光染色觀察小窩蛋白-3與肌動(dòng)蛋白微絲的共定位;
　　8.大鼠血清和心肌組織中NO含量測定:應(yīng)用NO測定試劑盒檢測大鼠血清和心肌組織勻漿中NO的含量;
　　9

30、.實(shí)時(shí)定量PCR檢測:取大鼠心肌組織，Trizol法提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測profilin-1、eNOS、小窩蛋白-3mRNA相對表達(dá)量;
　　10.Western blot檢測:取大鼠心肌組織，提取蛋白，Western blot檢測profilin-1，eNOS，p-eNOS和小窩蛋白-3的蛋白表達(dá)量。
　　研究結(jié)果：
　　1.各組大鼠血壓變化:整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中（5周齡-17周齡）SHR大鼠血壓隨

31、周齡增加而升高，且顯著高于同周齡WKY大鼠血壓;實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與SHR-C組相比，SHR-I組血壓略下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與SHR-C組相比，SHR-H組血壓略升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示profilin-1過表達(dá)和沉默對SHR大鼠血壓無明顯影響。
　　2.心臟質(zhì)量指數(shù)測定:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠左室重量/心臟重量、左室長軸均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與SHR-C組大鼠相比，SHR-I組大鼠左室重

32、量/心臟重量(P＜0.05)、左室長軸(P＜0.01)均明顯減小，而SHR-H組大鼠左室重量/心臟重量、左室長軸均明顯增加(P＜0.05)。profilin-1過表達(dá)加重SHR大鼠心肌肥大，同時(shí)profilin-1基因沉默顯著減輕了SHR大鼠心肌肥大。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染效率檢測:采用天空藍(lán)染色屏蔽自發(fā)熒光后，各組大鼠心肌組織中綠色熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的30％～35％，注射生理鹽水的WKY大鼠和SHR大鼠心肌組織中檢測不到綠色熒光細(xì)

33、胞。
　　4.心肌組織病理學(xué)分析
　　4.1、心肌HE染色:與WKY大鼠相比，SHR大鼠心肌細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變;與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠的心肌細(xì)胞腫脹更加明顯，部分心肌呈灶狀與片狀壞死，伴有脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤。相反，SHR-I組大鼠心肌細(xì)胞的病理損傷明顯減輕。
　　4.2、心肌天狼星紅染色:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌膠原分布明顯增

34、多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠心肌膠原分布明顯增多(P＜0.001)，而SHR-I組大鼠心肌膠原分布明顯減少(P＜0.001)。這些結(jié)果表明profilin-1基因的高表達(dá)促進(jìn)高血壓誘導(dǎo)的心肌纖維化，而profilin-1基因沉默則有助于減輕心肌纖維化程度。
　　5.心肌超微結(jié)構(gòu)觀察:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維排列紊亂，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)浪狀破壞，Z線斷裂

35、成波，線粒體形態(tài)異常，數(shù)量增多且排布紊亂，線粒體嵴模糊不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達(dá)，提示合成分泌功能旺盛，符合心肌肥厚表現(xiàn);與SHR-C組相比，SHR-H組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)破壞更為嚴(yán)重，大片區(qū)域肌原纖維皺縮或崩解，閏盤及Z線不清，線粒體嚴(yán)重腫脹，線粒體嵴斷裂甚至消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大，胞核呈早期凋亡形態(tài)，大量的膠原纖維增生，可見其將肥大的心肌細(xì)胞包繞分隔成束;而SHR-I組大鼠心肌細(xì)胞肌原纖維含量較SHR-C組大鼠明顯增加，肌節(jié)較規(guī)則，線粒

36、體輕度腫脹，線粒體內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)較少，心肌細(xì)胞核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻，邊集現(xiàn)象不明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯，偶有點(diǎn)狀膠原纖維增生。
　　6.心肌中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變:WKY-C組大鼠心肌中鬼筆環(huán)肽熒光染色豐富，而SHR-C組大鼠中染色細(xì)弱，提示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架含量下降;與SHR-C組大鼠相比，降低profilin-1的表達(dá)有助于肌動(dòng)蛋白微絲結(jié)構(gòu)和含量的保存，而profilin-1高表達(dá)則進(jìn)一步減低肌動(dòng)蛋白微絲的含量。
　　7.

37、心肌細(xì)胞膜上小窩豐度的檢測:WKY-C組大鼠心肌中小窩的數(shù)量是SHR-C組大鼠的3倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.001)，與SHR-C組相比，SHR-H組心肌纖維膜上小窩的數(shù)量進(jìn)一步減低(P＜0.001)，而profilin-1的沉默則有助于保存SHR-I組小窩的豐度(P＜0.001)。實(shí)時(shí)定量PCR和westernblot的結(jié)果顯示SHR-H組大鼠心肌小窩蛋白-3的mRNA含量是SHR-C組大鼠的1.66±0.33倍(P＜0.05)，其

38、蛋白含量是SHR-C組大鼠的1.71±0.21倍(P＜0.001);而SHR-I組大鼠心肌小窩蛋白-3的mRNA含量是SHR-C組大鼠的42.5±2.6％(P＜0.01)，其蛋白含量是SHR-C組大鼠的33.6±3.2％(P＜0.001)，小窩蛋白-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平與肌漿膜上小窩的數(shù)量相一致。
　　8.大鼠心肌組織中profilin-1的表達(dá)水平及細(xì)胞定位:實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，SHR-C組大鼠肥大心肌中profili

39、n-1的mRNA水平較WKY-C組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，SHR-H組大鼠心肌組織中profilin-1的mRNA水平較SHR-C組上調(diào)了38.10％(P＜0.05)，而SHR-I組profilin-1的mRNA表達(dá)水平較SHR-C組降低了44.29％(P＜0.05);Westernblot結(jié)果顯示，SHR-C組大鼠肥大心肌中profilin-1的蛋白水平較WKY-C組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，

40、與SHR-C組相比，SHR-H組大鼠心肌profilin-1蛋白水平上調(diào)了約35.29％(P＜0.05)，而SHR-I組profilin-1蛋白表達(dá)下調(diào)了38.24％(P＜0.01);免疫組化圖片顯示profilin-1蛋白表達(dá)在心肌細(xì)胞漿內(nèi)，尤其在核周分布，在血管平滑肌細(xì)胞中也見到profilin-1微弱的表達(dá)，profilin-1在各組大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平與westernblot結(jié)果一致。
　　9.大鼠血清和心肌組織中NO

41、的含量:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠肥大心肌中NO含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，SHR-H組心肌組織中NO含量明顯低于SHR-C組(P＜0.01)，而SHR-I組心肌組織中NO含量則明顯高于對照組(P＜0.05)。同時(shí)，我們檢測了血清中NO水平，結(jié)果顯示SHR-I組、SHR-C組和SHR-H組大鼠血清中NO水平無顯著差異，這提示profilin-1的高表達(dá)和沉默所引起的NO水平的變化是心肌組織內(nèi)的局部變化

42、而非系統(tǒng)性反應(yīng)。
　　10.大鼠心肌組織中eNOS表達(dá)水平和活性檢測:實(shí)時(shí)定量PCR和westernblot結(jié)果顯示四組大鼠心肌中eNOS的表達(dá)水平無顯著差異。進(jìn)而檢測eNOS在Ser1177位點(diǎn)上的磷酸化水平以觀察eNOS的活性，結(jié)果顯示，與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠心肌中eNOS的活性明顯減低;與SHR-C組大鼠相比，SHR-H組大鼠心肌中磷酸化eNOS的表達(dá)明顯降低而SHR-I組的磷酸化eNOS的表達(dá)明顯升高，差

43、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌組織中，profilin-1的表達(dá)上調(diào)，伴隨心肌細(xì)胞肥大、膠原纖維增生和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架受損。
　　2.Profilin-1的過表達(dá)通過影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組裝，干擾心肌纖維膜上小窩的形成，抑制eNOS/NO信號(hào)通路的活性而促進(jìn)高血壓誘導(dǎo)的心肌肥大，是高血壓心肌肥大的重要發(fā)病機(jī)制。
　　3.Profilin-1基因沉默主要通過增加心