Hrd1在香煙煙霧誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用.pdf

1、目的：觀察原代培養(yǎng)的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）暴露于香煙煙霧提取物（CSE）不同時(shí)間凋亡率的變化，以及AECⅡ中Hrd1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)因子、ERS誘導(dǎo)性凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化；觀察Hrd1基因沉默/過表達(dá)對上述變化的影響；探索Hrd1在COPD關(guān)于肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制中所起的作用。
　　方法：原代及傳代培養(yǎng)大鼠AECⅡ；制備CSE；用攜帶Hrd1干擾序列/編碼序列的慢病毒侵染AECII沉默/過表達(dá)Hrd1基因

2、；在10％CSE刺激AECII的0h、3h、6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)：Hoechst染色檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率、Realtime-PCR、Western blot技術(shù)檢測干預(yù)前后Hrd1、PERK、P-PERK、eIF2α、P-eIF2α、IRE1、P-IRE1、ATF6、caspase12、JNK、P-JNK、CHOP的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴傳至第3代培養(yǎng)的細(xì)胞，其形態(tài)、生長特征及生理學(xué)特性與原代培養(yǎng)細(xì)胞無明顯差異。⑵H

3、oechst染色顯示：暴露于10%CSE的大鼠AECⅡ其凋亡率隨著刺激時(shí)間的延長不斷升高；敲除Hrd1基因組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)凋亡率較野生型明顯增加；過表達(dá)Hrd1基因組細(xì)胞凋亡率較野生型明顯降低。⑶Westen blot結(jié)果顯示：10%CSE作用不同時(shí)間PERK、eIF2α以及IRE1總蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5），野生型細(xì)胞P-PERK的表達(dá)從3h組開始升高，12h達(dá)到高峰，后逐漸降低但仍高于對照組水平，P-eIF2α隨著CS

4、E暴露時(shí)間的延長呈遞增趨勢；沉默Hrd1基因后，P-PERK的表達(dá)從3h組有所升高，6h開始即表達(dá)稍降并隨著CSE作用時(shí)間的延長顯著降低，而P-eIF2α蛋白的表達(dá)則隨著作用時(shí)間的延長呈持續(xù)下降趨勢；過表達(dá)Hrd1基因后，P-PERK蛋白的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長不斷減少，而P-eIF2α的表達(dá)從3h組稍有升高，12h組最高，隨后根據(jù)CSE作用時(shí)間的延長顯著降低。野生組P-IRE1的表達(dá)隨著CSE暴露時(shí)間的延長呈遞增趨勢；沉默組P-IRE

5、1的表達(dá)從3h開始逐漸升高，12h達(dá)高峰，24h、48h表達(dá)均下降；過表達(dá)組P-IRE1的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長不斷增加。野生組ATF6α的表達(dá)隨著CSE暴露時(shí)間的延長呈遞增趨勢；沉默組ATF6α蛋白的表達(dá)則隨著作用時(shí)間的延長呈持續(xù)下降趨勢；過表達(dá)組ATF6α的表達(dá)從3h開始逐漸降低，6h最低，12h開始表達(dá)增加并在24h、48組持續(xù)增加。⑷Westen blot結(jié)果顯示：10%CSE作用不同時(shí)間總JNK蛋白的表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義（P＞0.5），P-JNK的表達(dá)隨著CSE暴露時(shí)間的延長呈遞增趨勢，caspase12的表達(dá)從3h組開始升高，12h達(dá)到高峰，隨后逐漸降低但仍高于對照組水平。CHOP蛋白的表達(dá)在野生組隨著CSE暴露時(shí)間的延長不斷增加，在沉默組從3h組開始升高，12h達(dá)最高峰，之后隨著CSE作用時(shí)間的延長逐漸下降但表達(dá)始終高于對照組，在過表達(dá)組隨著CSE作用時(shí)間的延長持續(xù)升高。
　　結(jié)論：①在適宜的培養(yǎng)條件下，離體培養(yǎng)的第3代AECⅡ能夠維持