大鼠尾椎間盤退變過程中COMP、ADAMTS-7、ADAMTS-12的動態(tài)表達變化研究.pdf

1、COMP(Cartilage oligomeric matrix protein)是軟骨組織內(nèi)一種非膠原蛋白成分。除軟骨外,該蛋白同樣也存在于肌腱、骨和滑膜中。COMP分子是由5個分子量110kD單體聚合而成的五聚體。在以往的研究中,COMP已被證明具備催化膠原纖維形成的能力,并可與膠原和軟骨聚集蛋白聚糖(aggrecan)等相結(jié)合。COMP與膠原及軟骨聚集蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)主要成分可以相互結(jié)合預(yù)示著COMP在基質(zhì)中可能起到舉足輕重的

2、作用。近來,人們發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶家族——ADAMTS(a disilategrin and metalloproteinase with thrombospondinmotifs)可以分解細胞外基質(zhì)成分。ADAMTS家族于1997年被發(fā)現(xiàn),并被證實有重要的生物學作用。在ADAMTS家族成員中,ADAMTS-7和ADAMTS-12具有金屬蛋白酶特性,可以直接結(jié)合并分解COMP。ADAMTS-7在骨、軟骨、滑膜、肌腱和韌帶中均有表達,ADAM

3、TS-12在軟骨、滑膜和肌腱中有表達。COMP也在以上提及的各個組織中有表達。曾有學者報道在正常椎間盤中亦發(fā)現(xiàn)COMP的存在,但正常椎間盤中是否有ADAMTS-7以及ADAMTS-12表達,并且在間盤退變過程中ADAMTS-7、ADAMTS-12以及COMP是否會有相關(guān)的變化都未見國內(nèi)外文獻報道。
　　 目的：
　　 眾所周知,在椎間盤退變過程中諸如髓核纖維化等組織形態(tài)上的變化是由于細胞丟失和細胞外基質(zhì)降解所導致。椎間盤

4、細胞外基質(zhì)降解包括間盤中蛋白多糖、水和Ⅱ型膠原的丟失。在這個降解過程中,椎間盤活性細胞是不斷減少的。在本實驗中,我們建立了符合上述特點的間盤退變模型,并在此基礎(chǔ)上觀察了間盤退變過程中COMP,ADAMTS-7及ADAMTS-12的動態(tài)改變。本實驗首次報道了髓核中ADAMTS-7和ADAMTS-12的表達情況以及在間盤退變過程中ADAMTS-7、ADAMTS-12和COMP的表達改變情況。
　　 材料與方法
　　 動物分組

5、:本研究采用平均體重為350-400g的SD大鼠。實驗動物隨機分為實驗組和對照組。實驗組中的大鼠分為6組每組8只,每只大鼠于第4和第5尾椎之間的尾椎間盤施加恒定的1.3MPa靜壓力,加壓時間點為6小時、12小時、18小時、1天、4天及7天,每個時間點以過量氯胺酮處死一組大鼠并取材。對照組大鼠的尾椎間盤不施加任何靜壓力,其分組和取材與實驗組一樣。
　　 間盤退變模型的建立:通過對尾椎間盤施加靜壓力建立退變模型的方法國外曾有報道[1

6、8]。大鼠以氯胺酮麻醉后,通過觸診辨別出第4,5尾椎問盤,以小型電鉆將直徑為0.4毫米的不銹鋼針經(jīng)皮鉆入鄰近間盤的椎體,在每個椎體中垂直鉆入兩個鋼針,相鄰兩椎體鋼針保持平行。用帶有刻度的彈力皮套套入相鄰兩椎體的平行鋼針末端,從而對椎間盤施加1.3MPa的靜力壓。將塑料圓筒套至受壓椎體及椎間盤的表面以防大鼠啃咬。尾椎間盤施壓期間大鼠允許自由活動。在加壓不同時間點(6小時、12小時、18小時、1天、4天及7天),以過量氯胺酮處死相應(yīng)的大鼠。

7、取出間盤中的髓核作進一步的試驗研究。
　　 細胞凋亡:取材后制成組織切片,切片中的凋亡細胞用以Tunel法測定。Tunel試驗步驟根據(jù)試劑盒說明書進行(Roche)。切片中染成棕黃色的陽性細胞即為凋亡細胞。以PCI軟件行顯微鏡下圖像捕捉及凋亡的陽性細胞計數(shù)。
　　 RNA提取:第4,5尾椎間盤的髓核在取材后以顯微器械仔細分離出來后用于RNA提取,總RNA以RNAisoTM Plus(Takara)提取,提取步驟依照說明書

8、操作?？俁NA量以微量測樣器(Implen)測量。
　　 RT-PCR:應(yīng)用。TAKARA RNA PCR Kit(AMV)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄PCR。首先反轉(zhuǎn)錄50ng的總RNA成為CDNA。依據(jù)試劑盒說明書配制50μl的PCR體系。引物序列參看表1。PCR.反應(yīng)采取35個循環(huán),每個循環(huán)的具體條件為:(1)變性:95℃1分鐘;(2)退火:時問為1分鐘,各目的基因的退火溫度各不相同,ADAMTS-7,ADAMTS-12及COMP退火

9、溫度為60℃,collagenⅡ退火溫度為56℃,aggrecan退火溫度為61℃,GAPDH退火溫度為58℃;(3)延伸:72℃1分鐘。擴增之后進行2％的瓊脂糖凝膠電泳分析擴增之后的PCR產(chǎn)物。目的條帶以GeneFinder染色并以熒光顯像儀成像。
　　 蛋白提取及Western Blot:取材后以顯微器械仔細分離髓核,以含有蛋白酶抑制劑PMSF的蛋白裂解液將髓核裂解60分鐘。以BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)進行蛋白定量,具體

10、步驟依據(jù)廠商說明書。等量的組織蛋白(50gg)在100V電壓下進行SDS-PAGE電泳3小時后,將凝膠上的條帶在70V電壓下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以COMP一抗(Abcam)孵育后,TBS液漂洗,0.5％BSA進行封閉,而后用二抗孵育(北京中杉),TBS漂洗,最后進行ECL發(fā)光。
　　 結(jié)果
　　 Tunel法細胞凋亡
　　 在實驗組中,施加靜力壓1天后髓核開始出現(xiàn)凋亡細胞。靜力壓持續(xù)施加7天時,可觀察到

11、髓核中大量出現(xiàn)凋亡細胞。而未施加靜力壓的對照組大鼠尾椎間盤中未觀察到凋亡的陽性細胞(圖1.11.21.3)
　　 細胞外基質(zhì)主要成分的表達
　　 RT-PCR結(jié)果表明大鼠尾椎間盤靜力加壓時間少于18小時H型膠原的表達無明顯變化,18小時后其表達呈降低趨勢,加壓至1天后Ⅱ型膠原表達開始顯著降低。Aggrecan的表達變化趨勢與Ⅱ型膠原相似。
　　 大鼠尾椎髓核中的COMP基因表達是隨著靜力加壓時間的變化而變化的。靜

12、力加壓至18小時,COMP表達呈明顯上升趨勢,加壓18小時后COMP表達呈下降趨勢。在靜力加壓18小時時間點COMP表達呈顯著升高。當靜力加壓持續(xù)至4天以后,COMP表達出現(xiàn)顯著減少。COMP的蛋白表達趨勢與其RT-PCR表達趨勢一致。在COMP的Westernblot實驗中檢測到大小約65kD的COMP片斷,該片斷的表達在間盤加壓1天后顯著增加。
　　 細胞外基質(zhì)中ADAMTS-7,ADAMTS-12在間盤退變過程中的表達變化

13、
　　 在正常的SD大鼠尾椎間盤中有ADAMTS-7及ADAMTS-12的表達。在間盤退變過程中,其表達總體呈增加趨勢,與間盤基質(zhì)主要成分表達趨勢相反。ADAMTS-7及ADAMTS-12的表達自間盤靜力加壓1天起出現(xiàn)顯著升高。在間盤靜力加壓7天時間點觀察到ADAMTS-12的表達仍具有統(tǒng)計學意義的顯著升高,但在此時間點ADAMTS-7的表達則回落至正常水平,未見明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 本實驗證實了ADAM