替硝唑?qū)M小鼠的亞急性毒性及利用RP-HPLC法對(duì)其在組織中代謝消除的檢測(cè).pdf

1、替硝唑(TNZ)屬于硝基咪唑類藥物，在動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)人具有潛在致癌性，農(nóng)業(yè)部規(guī)定在動(dòng)物源性食品中的最大殘留限量為零。本研究通過(guò)對(duì)KM小鼠的血液、肌肉、肝臟的殘留檢測(cè)，選擇最適宜的TNZ殘留檢測(cè)部位；根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所使用的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，為相關(guān)的檢測(cè)部門提供動(dòng)物性食品中比較簡(jiǎn)便可行的TNZ快速無(wú)損檢測(cè)的RP-HPLC法；探討TNZ對(duì)機(jī)體可能產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，為動(dòng)物性食品的安全性提供可靠的毒理學(xué)依據(jù)；還根據(jù)RP-HP

2、LC法所測(cè)定的TNZ在血液、肌肉和肝臟中的濃度數(shù)據(jù)，模擬出TNZ在KM小鼠機(jī)體內(nèi)的代謝消除趨勢(shì)，由此測(cè)算其代謝消除時(shí)間，為推測(cè)動(dòng)物性食品中TNZ代謝消除時(shí)間提供參考。 將100只實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩批。第一批60只KM小鼠分為5組，使用灌胃法每日按照100mg/kg體重的劑量灌胃TNZ藥液，連續(xù)5d。5d后，按照投藥后不同時(shí)間段進(jìn)行處死采樣。采樣結(jié)束后將血漿樣品在13000r/min，4℃離心10min，分離出血清以后，吸取0.5ml

3、血清加入0.2ml的甲醇，渦旋混合1min后再加入0.8ml乙腈，渦旋3-5min至混合均勻，靜置10min以上。然后以10000r/min，4℃離心10min后，再次以相同條件將上清液離心，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。肌肉、肝臟組織樣經(jīng)過(guò)勻漿處理后取0.5g，后面處理同血液樣品。 第二批40只KM小鼠進(jìn)行30d的蓄積性毒性實(shí)驗(yàn)。分為4組，按照0mg/kg、100mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg體重進(jìn)行灌胃TNZ藥

4、液。30d以后進(jìn)行處死采樣。進(jìn)行血液生化指標(biāo)測(cè)定的部分取0.3ml血清加入酶試劑以后，使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)；進(jìn)行TNZ殘留含量測(cè)定的部分按照第一批血樣與組織樣的處理辦法處理后，上機(jī)檢測(cè)。 HPLC測(cè)定采用PhenomenexHypercloneBDS-C18柱(150×4.6mm,5μm)，以甲醇：水(25：75)為流動(dòng)相，流速1.0ml/min。檢測(cè)溫度30℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)310nm。 結(jié)果表明，TNZ在血液與

5、肌肉的殘留期長(zhǎng)，殘留量高，但是肌肉的回收率與精密度更好，所以應(yīng)該選擇肌肉作為檢測(cè)的目標(biāo)。為了防止漏檢，可同時(shí)檢測(cè)血液作為參考。 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)所采取的RP-HPLC法，可以實(shí)現(xiàn)TNZ在動(dòng)物性食品中的快速無(wú)損檢測(cè)。樣品損耗少，檢出率高，相對(duì)回收率高，變異系數(shù)較小。在不同的組織中相對(duì)回收率不同。血液與肌肉的平均相對(duì)回收率＞95％，肝臟中平均相對(duì)回收率＞82％；血液與肌肉的日內(nèi)變異系數(shù)均＜7％；肝臟的平均日內(nèi)變異系數(shù)＜18％；日間變異系數(shù)

6、：肌肉(9％)＜血液(13％)＜肝臟(19％)。組織中的最低檢測(cè)限為1.25×10-5μg/ml，最低定量限為1.25×10-4μg/ml。樣品濃度范圍在0.008-111.26μg/ml時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線與峰面積呈線性關(guān)系。 根據(jù)小鼠的臨床癥狀與病理變化以及臟器指數(shù)，可以得出TNZ對(duì)多種器官都有不利影響。血清生化指標(biāo)中A/G、白蛋白、尿素氮、肌酐這4個(gè)指標(biāo)，各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)值差異比較小。總蛋白、球蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶這

7、五個(gè)指標(biāo)各組數(shù)值差異較大，而且劑量組測(cè)定結(jié)果均高于對(duì)照組。多種指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，TNZ的長(zhǎng)時(shí)間使用可以導(dǎo)致各種器質(zhì)性與功能性的病變，尤其是大劑量的服用，此種不利影響尤為明顯?？梢缘贸鯰NZ的長(zhǎng)期使用對(duì)多種器官、組織都有毒性。 TNZ在KM小鼠機(jī)體內(nèi)的代謝消除時(shí)間選擇代謝期長(zhǎng)的血液與肝臟組織進(jìn)行計(jì)算，血液的代謝消除公式：Y=116.98e-0.3817x(R2=0.76)。當(dāng)血液中TNZ濃度要下降到0.001μg/ml需要30.5