有氧脅迫下幽門螺桿菌球形變異相關(guān)蛋白的鑒定及功能研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是人類慢性活動性胃炎和消化潰瘍的重要原因，與胃癌和胃淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生也極度相關(guān)。目前人類對其生物學(xué)特點、致病機制及其與宿主的關(guān)系等方面均尚未完全闡明。隨著對Hp在分子水平上的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Hp較其它細菌表現(xiàn)出更高的生物多樣性，提示該菌面對復(fù)雜的定居環(huán)境，具有高度的變異性和獨特的適應(yīng)性機制。大量研究發(fā)現(xiàn)，Hp在各種不利因素的作用下可發(fā)生形態(tài)變異，由螺旋體轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐误w。H

2、p作為一種專性微需氧菌，在有氧脅迫下更容易發(fā)生適應(yīng)性變異，轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N有活力但不能培養(yǎng)成活(viablebutnoculturablestage,VNC)的Hp球形變異體，其在Hp感染的傳播途徑及其相關(guān)消化系統(tǒng)疾病的復(fù)發(fā)中可能發(fā)揮著重要作用。研究Hp在有氧脅迫下發(fā)生適應(yīng)性球形變異的變異特征及其變異本質(zhì)，解析Hp的適應(yīng)性調(diào)節(jié)元件，將為揭示Hp可能的傳播途徑、闡明Hp的適應(yīng)性變異機制，以及創(chuàng)新性地開展基因工程改造Hp菌株耐氧培養(yǎng)的研究提供有力

3、的實驗依據(jù)。Hp菌26695株和J99株全基因組測序工作的完成，為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了條件。近幾年，國內(nèi)外研究者采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相繼在Hp的遺傳變異、生理、免疫靶點篩選及毒力因子確定等方面進行了一系列的研究，而在有氧脅迫下Hp發(fā)生適應(yīng)性球形變異方面卻未見相關(guān)研究報道。 本研究選擇Hp臨床分離株，采用高氧濃度的培養(yǎng)條件，有氧脅迫Hp發(fā)生球形變異，建立穩(wěn)定的球形體模型，進而對Hp球形體的超微結(jié)構(gòu)、菌體代謝、酶活特性、毒力因子

4、mRNA水平表達差異、體內(nèi)外回復(fù)定植力等變異特征進行實驗研究。同時，采用目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)——雙向電泳，對適應(yīng)性變異前后的Hp螺旋體和球形體進行全菌蛋白質(zhì)表達譜的比較分析，再通過MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對差異蛋白進行初步鑒定分析，最后通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建差異蛋白相關(guān)基因的Hp高表達菌株，驗證該基因在有氧脅迫條件下對Hp氧耐受性的作用。具體研究結(jié)果如下： 1.有氧脅迫下Hp球形體的變異特征研究：針對Hp5％的微需氧培

5、養(yǎng)要求，采用與大氣氧分壓(20％)相一致的高氧濃度培養(yǎng)條件，有氧脅迫Hp發(fā)生球形變異，建立穩(wěn)定的球形體模型，進而對Hp球形體的超微結(jié)構(gòu)、菌體代謝、酶活特性、毒力因子表達差異等變異特征進行實驗研究。結(jié)果表明，隨著有氧脅迫時間的延長，Hp螺旋體逐漸轉(zhuǎn)化為球形體，菌體代謝水平及相關(guān)酶活性逐漸下降并趨于穩(wěn)定；而采用實時熒光定量PCR對Hp定居毒力及抗氧化相關(guān)基因進行mRNA水平表達差異比較的結(jié)果顯示，Hp球形體被檢基因的表達水平均較螺旋體有所減

6、少。其中cagA、vacA、hpaA基因的表達降低幅度較大，而ureB、sodB、kat基因的表達降低幅度較小。研究結(jié)果提示，Hp球形體在相關(guān)酶活性和基因表達水平存在差異，表明該基因編碼的蛋白在Hp有氧脅迫條件下的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制及維持菌體存活中可能發(fā)揮著重要的作用。 2.Hp球形體的回復(fù)性實驗研究：前述研究結(jié)果提示，有氧脅迫下誘導(dǎo)形成的Hp球形體其代謝活性和毒力均有所降低，但并未完全喪失。它脫離了不利環(huán)境后也許會重新復(fù)蘇，回復(fù)為

7、可培養(yǎng)增殖的螺桿狀Hp而再次致病。本研究在布氏肉湯的基礎(chǔ)上設(shè)計了幾種培養(yǎng)基，同時采用有氧脅迫誘導(dǎo)的Hp球形體感染蒙古沙鼠(Mongoliangerbil)，觀察Hp球形體在體內(nèi)、體外可能發(fā)生的回復(fù)現(xiàn)象。結(jié)果顯示，在設(shè)計的四種固、液體培養(yǎng)基中，Hp球形體均未能在體外回復(fù)生長；而在用Hp球形體感染沙鼠的體內(nèi)實驗中卻觀察到了球形Hp的回復(fù)定植。同時，感染小鼠胃粘膜的Hp定量培養(yǎng)和組織學(xué)檢測結(jié)果顯示，Hp螺旋體感染組在小鼠胃內(nèi)的定植密度較高，且

8、胃粘膜下可見大量炎癥細胞浸潤；而球形體感染組并未見到小鼠胃粘膜組織的明顯炎癥損傷，且僅有少量回復(fù)的螺旋體定植。本研究證實，Hp球形體作為一種低水平代謝休眠體，代謝活性及毒力雖均有所減弱，但仍具有潛在的致病性；本研究支持至少部分Hp球形體具有活力但體外不能培養(yǎng)成活這一假說，提示“糞-口”傳播應(yīng)引起更多的關(guān)注。 3.Hp雙向電泳技術(shù)體系的建立：為了深入進行Hp的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，本課題通過比較以凍融和超聲為基礎(chǔ)兼加化學(xué)活性劑的Hp

9、菌體蛋白提取方法，旨在建立穩(wěn)定、有效的Hp蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系。結(jié)果表明，取1mg經(jīng)凍觸兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10一步法提取的Hp菌體蛋白，雙向電泳圖譜經(jīng)分析顯示，有521±36個蛋白斑點，但有“暈輪”效應(yīng)和“紋理”效應(yīng)；而分別取1mg和2mg經(jīng)超聲兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10一步法提取的Hp菌體蛋白，分析顯示分別有603±12個和638±29個蛋白斑點，且蛋白斑點明顯，界限清晰。結(jié)果證實超聲兼化學(xué)

10、活性劑法是有效裂解細菌并高效提取菌體蛋白的方法。 4.Hp球形變異相關(guān)蛋白的篩選與鑒定：在建立了穩(wěn)定、高效Hp蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)體系的基礎(chǔ)上，本研究采用微需氧培養(yǎng)的典型HP螺旋體和有氧脅迫下形成的Hp球形體進行全菌蛋白質(zhì)表達譜的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。雙向電泳圖譜經(jīng)PDQuest6.0軟件分析，兩者的總蛋白分布模式基本相似，電泳圖譜的平均相關(guān)系數(shù)為0.67。CBB染色可分別檢出635±18和614±27個蛋白點。選擇差異最明顯，點

11、光密度值較大的10個蛋白點，用MALDI-TOF-MS進行肽質(zhì)量指紋圖譜分析和數(shù)據(jù)庫查詢，結(jié)果成功鑒定出7個差異蛋白。其中翻譯延長因子Tu(EF-Tu)、尿素酶G(UreG)、丙酮酸-黃素蛋白氧化還原酶(POR)、超氧化物歧化酶(SOD)、熱休克蛋白10(Hsp10)的表達量在Hp球形體中顯著升高；而黃素氧化還原蛋白(Fld)、烷基化氫化氧化酶(Ahp)則在Hp螺旋體中高表達。經(jīng)文獻檢索證實，EF-Tu是與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的蛋白，其在Hp

12、球形體中的表達量增高，說明球形體的蛋白質(zhì)翻譯過程并未停止。POR和Fld是與能量代謝相關(guān)的蛋白，它們在Hp中的差異表達，表明Hp球形體作為一種低水平代謝休眠體，其能量代謝并未停止。而UreG和Hsp10作為尿素酶合成的輔助蛋白和分子伴侶，在Hp球形體中的高表達，可能在維持Hp球形體的尿素酶活性和穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。同時研究證實，SOD作為生物體防御氧化損傷的重要金屬酶系之一，能特異清除生物體在有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基(O-2

13、)。其在Hp球形體中的高表達提示，SOD可能作為Hp在有氧脅迫條件下的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)蛋白，在清除ROS、維持機體氧化與抗氧化平衡、保持菌體存活中起著至關(guān)重要的作用。 5.sodB基因在Hp中的高表達及其對Hp氧耐受性影響的實驗研究：本研究首先以HpM13菌株基因組DNA為模板，通過PCR擴增HpsodB基因序列，將其克隆到含GFP的質(zhì)粒pAcGFP中，構(gòu)建了pAc-sodB-GFP示蹤表達載體。再以重組質(zhì)粒pAc-sodB-GF

14、P為模板，通過PCR擴增sodB-gfp融合基因及其前端的Lac啟動序列，將其克隆到含有HppHell復(fù)制子的質(zhì)粒pMuH36中，獲得重組表達質(zhì)粒pMuH36-sodB-GFP，將其電轉(zhuǎn)化HpM13菌株，重組菌命名為HpPSG。通過SDS-PAGE、Westernblotting、熒光顯微鏡觀察、SOD表達活性的檢測，證實sodB基因在重組菌HpPSG中高表達。 同時，重組菌HpPSG在不同氧分壓條件下對氧耐受性的實驗研究結(jié)果發(fā)

15、現(xiàn)，在10％氧分壓氣體環(huán)境下，HpPSG在誘導(dǎo)后即SOD高表達后其生長曲線與HpM13未轉(zhuǎn)化菌存在較明顯差異(0.05＞P＞0.01)。HpM13未轉(zhuǎn)化菌在培養(yǎng)至64h左右其球形體形成率已接近80％；而HpPSG在同樣條件下其活菌濃度仍保持穩(wěn)定，鏡下觀察菌體形態(tài)典型，直至56h才見有少量球形體形成。其球形體形成時間及形成率與HpM13未轉(zhuǎn)化菌相比較，也存在較明顯差異(0.05＞P＞0.01)。結(jié)果表明，SOD在重組菌HpPSG中的高表達