幽門(mén)螺桿菌sabA基因的克隆表達(dá)及江西地區(qū)幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白的序列特征.pdf

1、研究背景與目的：
　　 外膜蛋白與H.pylori的定植、胃黏膜的損傷、炎性介質(zhì)的分泌和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)等有著密切關(guān)系，同時(shí)它是激發(fā)免疫反應(yīng)的主要成份，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的菌株特異性免疫反應(yīng)，這在H.pylori的致病中起重要作用。H.pylori感染后的轉(zhuǎn)歸主要受細(xì)菌因素、宿主因素和環(huán)境因素三者的影響，其中細(xì)菌因素在H.pylori感染結(jié)局的多樣性中起重要作用，H.pylori毒力因子的基因多態(tài)性也是重要原因。以往對(duì)H.pylori毒

2、力的研究多集中在尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(Cag)、空泡毒素(VacA)等方面上，而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)H.pylori外膜蛋白與其定植、炎性介質(zhì)的分泌、胃黏膜的損傷和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)等有著密切關(guān)系。為了研究H.pylori疫苗的候選抗原成分和更好的防治H.pylori感染，本文將構(gòu)建H.pylori外膜蛋白唾液酸結(jié)合黏附素(SabA)的重組質(zhì)粒并檢測(cè)其體外表達(dá)重組蛋白的抗原性和分析來(lái)自江西臨床H.pylori菌株的前炎性外膜蛋白A(out

3、erinflammatory proteinA，OipA)、血型抗原結(jié)合黏附素(blood-group antigenbindingadhesion，BabA)、唾液酸結(jié)合黏附素(sialic acid-binding adhesion，SabA)的基因序列特征，并與來(lái)自東亞和非東亞地區(qū)的22株H.pylori的序列進(jìn)行比對(duì)，分析不同區(qū)域的序列特征。探明我國(guó)外膜蛋白的基因特征對(duì)于研究其與疾病的關(guān)系具有重要意義以及為SabA作為靶抗原的研

4、究奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.幽門(mén)螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達(dá)：
　　 (1)以H.pylori26695株基因組為模板，設(shè)計(jì)sabA基因特異性引物擴(kuò)增目的基因；
　　 (2)將PCR產(chǎn)物插入到pGEX-4T-1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)；
　　 (3)表達(dá)蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定，并用免疫印跡法評(píng)價(jià)其抗原性。
　　 2.幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白(OipA、BabA、

5、SabA)的基因序列特征分析：
　　 (1)對(duì)前期分離的154株臨床H.pylori菌株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，并提取其基因組DNA；
　　 (2)針對(duì)Hpylori外膜蛋白(OipA、BabA、SabA)設(shè)計(jì)多對(duì)特異性全長(zhǎng)測(cè)序引物；
　　 (3)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，并將其產(chǎn)物送于公司測(cè)序；
　　 (4)利用生物信息學(xué)軟件MEGA、AlignX、ClustalX2和相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行DNA序列、氨基酸序列比對(duì)，分析

6、江西地區(qū)的序列特征。
　　 (5)將江西臨床菌株序列與來(lái)自不同區(qū)域的22株H.pylori菌株序列進(jìn)行比對(duì)，分析不同區(qū)域的序列特征，找出江西地區(qū)菌株序列的特異性。
　　 結(jié)果：
　　 1.幽門(mén)螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達(dá)結(jié)果：
　　 (1)獲得H.pylori26695的唾液酸黏附素基因，并經(jīng)酶切鑒定基因sabA成功插入到pGEX-4T-1載體中。
　　 (2)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-sa

7、bA在大腸桿菌BL21中表達(dá)，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定為幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白SabA，且該蛋白具有抗原性。
　　 2.幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白(OipA、BabA、SabA)的基因序列特征分析結(jié)果：
　　 (1)擴(kuò)增出臨床菌株外膜蛋白的OipA、BabA、SabA三個(gè)基因，且多對(duì)引物PCR的三個(gè)基因陽(yáng)性率均為100％。根據(jù)DNA序列翻譯成氨基酸的方法，預(yù)測(cè)外膜蛋白OipA的蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性率為99.33％，BabA和SabA的蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性

8、率分別為75.89％和61.90％。babA基因序列有52.43％的堿基位點(diǎn)發(fā)生突變明顯高于sabA基因序列的49.28％，而翻譯成的氨基酸序列后，babA氨基酸序列有42.38％的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變明顯低于sabA氨基酸序列的46.96％，說(shuō)明babA的堿基位點(diǎn)突變多數(shù)為同義突變，DNA序列的變化不影響氨基酸的變化。
　　 (2)DNA序列比對(duì)聚類(lèi)分析結(jié)果：
　　 ①oipA基因中有257個(gè)堿基點(diǎn)發(fā)生了突變，占基因全長(zhǎng)

9、的27.81％，與不同地區(qū)的菌株序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)江西地區(qū)的菌株序列CT重復(fù)數(shù)不明顯。將序列聚類(lèi)可分為七大類(lèi)，其中來(lái)自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個(gè)小類(lèi)，而來(lái)自東亞地區(qū)的菌株序列卻分別與江西菌株序列聚為不同的小類(lèi)。
　　 ②babA基因中有1209個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，占基因全長(zhǎng)的52.43％，比對(duì)發(fā)現(xiàn)babA整個(gè)基因基因序列在600～1100位點(diǎn)存在一個(gè)高突變區(qū)域。將序列聚類(lèi)大致可以分為兩類(lèi)，其中來(lái)自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個(gè)類(lèi)別，而

10、來(lái)自韓國(guó)的菌株序列卻聚為一個(gè)小類(lèi)，來(lái)自日本的菌株序列分別與江西菌株序列聚為不同的小類(lèi)。
　　 ③sabA基因中有1021個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生了突變，占全長(zhǎng)基因的49.28％，比對(duì)發(fā)現(xiàn)sabA整個(gè)基因序列在0～100、200～1200位點(diǎn)存在兩個(gè)高突變區(qū)，與不同地區(qū)的菌株序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)江西臨床菌株序列不存在CT重復(fù)序列。將其聚類(lèi)可以分為兩個(gè)大類(lèi)，來(lái)自東亞地區(qū)的菌株序列與江西菌株序列聚為不同的小類(lèi)。
　　 (3)氨基酸序列比對(duì)聚類(lèi)分

11、析結(jié)果：
　　 ①oipA氨基酸序列中有81個(gè)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了突變，占全長(zhǎng)氨基酸序列的26.30％，其等電點(diǎn)在9.42～10.03之間，平均值為9.62；不穩(wěn)定指數(shù)在16.12～23.81之間，平均值為18.91；脂肪指數(shù)在77.30～82.11，平均值為79.73；親水值在-0.385～-0.255之間，平均值為-0.341。將所有推測(cè)出的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)聚類(lèi)分析，此聚類(lèi)圖顯示根據(jù)氨基酸的變化將氨基酸序列大致分為七類(lèi)，和DN

12、A序列聚類(lèi)是對(duì)應(yīng)的。
　　 ②babA的氨基酸序列中有317個(gè)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了突變，占全長(zhǎng)氨基酸序列的42.38％，其等電點(diǎn)在6.15～11.00之間，平均值為9.18；不穩(wěn)定指數(shù)在-1.86～43.61之間，平均值為21.59；脂肪指數(shù)在0～92.08，平均值為67.21；親水值在-1.575～0.020之間，平均值為-0.426。將所有推測(cè)出的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)聚類(lèi)分析，大致可以分為三個(gè)大類(lèi)，其中142號(hào)菌株的氨基酸序列和其

13、他菌株的氨基酸序列有著很大的差異性。
　　 ③sabA的氨基酸序列中有1021個(gè)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了突變，占全長(zhǎng)氨基酸序列的46.96％，其等電點(diǎn)在4.93～12.31之間，平均值為9.29，不穩(wěn)定指數(shù)在7.66～62.90之間，平均值為31.37；脂肪指數(shù)在71.78～149.41，平均值為90.60；親水值在-0.761～1.200之間，平均值為-0.181。將所有推測(cè)出的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)聚類(lèi)分析，大致可以分類(lèi)兩個(gè)大類(lèi)。