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文檔簡介
1、為獲得充足的CD7材料來源,以制備抗CD7基因工程抗體并研究CD7的作用機制,該文進行了以下工作:(1)人CD7膜外區(qū)cDNA在大腸桿菌中的表達,并對表達的融合蛋白進行了純化.(2)人CD7在哺乳類細胞中的表達并對其在LPS信號傳遞及細胞凋亡中的作用進行探討.主要研究內(nèi)容及結果:1.CD7膜外區(qū)cDNA在大腸桿菌中的表達及重組融合蛋白的純化;(1)通過PCR調(diào)整CD7膜外區(qū)cDNA的閱讀框架,使之與生物素化蛋白基因的閱讀框架一致.缺失了
2、編碼CD7信號肽的核甘酸序列,并增加了一個大腸桿菌偏性終止密碼子.(2)將陽性重組子轉入大腸桿菌DH5 α,用IPTG誘導重組融合蛋白的表達.2.人CD7在哺乳類細胞中的表達及其功能探討;(1)根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中人CD7 cDNA序列,設計并合成一段引物,通過PCR法從含CD7的質(zhì)粒中擴增得到了CD7全長cDNA,擴增片段經(jīng)XhoI、XbaI酶切后,同經(jīng)相同酶切的線性化質(zhì)粒pcIneo、pcDNA3連接構建了重組真核表達載體p
3、cIneo-CD7、pcDNA3-CD7. (2)通過電穿孔和磷酸鈣法將重組質(zhì)粒pcDNA3-CD7和空質(zhì)粒pcDNA3轉染HEK293細胞和Jurkat細胞,在有G418的條件下培養(yǎng)2~3周,篩選出G418抗性克隆,用RT-PCR和FCM對G418抗性克隆細胞進行分析.(3)LPS分別刺激HEK293/CD7細胞和HEK293后,用夾心ABC-ELISA法檢測細胞上清中IL-8含量.(4)PHA分別刺激CD7<'+>Jurkat和CD
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