人可溶性CD40L的克隆、表達(dá)及初步功能分析.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是危害人類健康的主要疾病，大量研究證實(shí)高膽固醇血癥特別是高低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDLC)血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素，其病理過程主要與動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉著有關(guān)。近年研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是脂質(zhì)代謝異常、血液凝集因子、細(xì)胞因子、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷、遺傳、行為性危險(xiǎn)因素以及可能的感染等多種因素相互作用的結(jié)果。其基本病理損害是一系列

2、特異性的細(xì)胞及分子的慢性炎癥反應(yīng)。動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理損害，即所謂的“脂質(zhì)條紋”，主要由單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞組成，是一種典型的炎癥病變，以后在多種因素的作用下，病變部位的免疫反應(yīng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞)進(jìn)一步增加和激活，并伴有脂質(zhì)聚集、血管內(nèi)膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)的沉著。研究觀察到，在炎癥性粥樣斑塊內(nèi)存在大量激活的CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。最近研究表明免疫炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生，發(fā)展過程中起著重要的作用，大量研究表明，

3、CD40配體(CD40L)參與了AS的炎癥反應(yīng).CD40L分子參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，即抗原呈遞和自身免疫反應(yīng)，與T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活有關(guān)。CD40配體，即CD154，一種與TNF家族同源的膜蛋白。CD40配體具有免疫細(xì)胞信號(hào)傳遞的功能，經(jīng)過CD40的信號(hào)，T細(xì)胞激活B細(xì)胞使B細(xì)胞增殖、分化成熟并且分泌抗體。近年的研究發(fā)現(xiàn)，CD40L的作用不只局限于炎癥細(xì)胞之間信號(hào)傳遞，還參與動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)主要細(xì)胞成分(包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬

4、細(xì)胞等)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。大量的報(bào)道證實(shí)，CD40L與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，成為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1-5]。人的CD40LmRNA長為1803bp，人CD40L以兩種形式存在，即可溶性和跨膜型，且兩者都具有生物學(xué)活性[6]。CD40L與它的受體CD40結(jié)合，通過胞內(nèi)信號(hào)因傳遞系統(tǒng)，參與AS發(fā)生，發(fā)展過程，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子和基質(zhì)降解酶.臨床研究表明，病人血液中可溶性CD40L含量與冠心病呈正相關(guān)[7]。

5、因此，CD40L有望成為抗動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)[8]。基于以上分析，我們進(jìn)行了人CD40LcDNA的克隆，重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，重組蛋白的原核表達(dá)、目的蛋白的純化及生物學(xué)活性的初步鑒定，旨在深入闡明CD40L在AS中的作用機(jī)制及進(jìn)一步研究和開發(fā)新型抗治動(dòng)脈粥樣硬化治療候選制劑奠定基礎(chǔ)。 目的：克隆編碼人可溶性CD40L氨基酸的cDNA，將其構(gòu)建于原核表達(dá)載體后，利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，最終獲得具

6、有生物學(xué)活性的重組目的蛋白。 材料與方法： 1.克隆編碼人可溶性CD40L氨基酸的cDNA。 2.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。酶切pUC19/sCD40L質(zhì)粒，將回收的目的片段sCD40L蛋白連接于原核表達(dá)載體pET-28a(+)。 3.目的蛋白的表達(dá)與鑒定。將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/sCD40L轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，根據(jù)優(yōu)化確定的IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并行SDS-PAGE

7、(5％積層膠，15％分離膠)檢測目的蛋白的表達(dá)情況。再經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlotting)鑒定目的蛋白的表達(dá)。 4.目的蛋白的分離純化。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌，鑒定目的蛋白的表達(dá)方式。將超聲碎菌離心后的上清過Ni2+-NTA柱純化目的蛋白，純化后的目的蛋白再過多粘菌素B柱以消除目的蛋白中的LPS對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。 5.體外生物學(xué)活性的初步鑒定。利用MTT法檢測重組蛋白刺激人外周血淋巴細(xì)胞和Raji細(xì)胞的增殖

8、情況。 結(jié)果： 1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人可溶性CD40L氨基酸的cDNA，片段長為648bp經(jīng)序列比對(duì)，與GenBank中報(bào)道的已知序列完全一致。 2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/sCD40L經(jīng)雙酶切后，可見大小約為648bp的片段。酶切結(jié)果表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 3.經(jīng)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化和篩選，確定了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度1mmol/L的IPTG，在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。SDS-PA

9、GE分析可見，表達(dá)的目的蛋白的大小約為30kDa。其中目的蛋白的表達(dá)量經(jīng)軟件分析，達(dá)到了細(xì)菌表達(dá)蛋白總量的約40％，主要是以分泌形式表達(dá)。經(jīng)WesternBlotting證實(shí)，在大小約為30kDa的位置有清楚的蛋白條帶。 4.目的蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后，再經(jīng)多粘菌素B柱有效地去除了LPS，純化的蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，證明目的蛋白得到有效的純化。 5.生物學(xué)活性的初步分析顯示，所制備的目的蛋白sCD

10、40L可有效地刺激人外周血淋巴細(xì)胞和Raji細(xì)胞的增殖。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)，成功地自人扁桃體組織克隆了編碼人sCD40L氨基酸的cDNA，并成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/sCD40L。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)均高水平地表達(dá)了目的蛋白，大小約為30kDa。經(jīng)分離純化后的目的蛋白表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)活性，從而證明了我們成功地利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了具有生物學(xué)活性的重