新生隱球菌分子生物學(xué)分類方法的研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文新生隱球菌分子生物學(xué)分類方法的研究姓名：鄒先彪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：皮膚病與性病學(xué)指導(dǎo)教師：廖萬(wàn)清;溫海2001.5.1論文：新生隱球菌分子生物學(xué)分類方法的研究m i 仃o c h o n d r i M p r e p a r e t i o n b y d i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n ．T h r e e p e l l e t s ，i

2、 n c l u d i n gy e a s tc e l l ，p r o t o p l a s t s ，m i t o c h o n d r i a l ，w e r e e x a m i n e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n i cm i c r o s c o p y 。2 0 灶gm t D N A w e r eo b t a i n e df r o

3、mC ．n e o f o r m a n s ，a n di t s p u r i t yw a se n o u g h ．A r a p i da n ds i m p l em e t h o d f o rt h ep r e p a r a t i o no f t h em i t o c h o n d r i a lD N A o fC ．n e o f o r m a n si s e s t a b l i s

4、h e d ．( c ) D e v e l o p m e n to f r a p i dm e t h o d sa n dc o m p a r i s o no fd i f f e r e n t m e t h o d s t o e x t r a c t D N Af r o m C ．n e o f o r m a n s ：D N A i s a n i m p o r t a n tf u n d a m e n

5、 t a lp r e r e q u i s i t et of i l r t h e rd o w n s t r e a mm o l e c u l a ra n a l y s e si n c l u d i n gn u c l e i ca c i d a m p l i f i c a t i o n t e c h n i q u e s ．I n t h i s s t u d y ，T w o s i m p

6、l e a n dr a p i d m e t h o d sf o re x t r a c t i n g g e n o m i c D N Aw e r e e s t a b l i s h e d a n d u s e d a s t e m p l a t e f o r P C R ．C o m p a r a t i v es t u d i e so f f o u rd i f f e r e n tD N A

7、 e x t r a c t i o nm e t h o d sw e r ee v a l u a t e di no u rs t u d yi no r d e r t o a s c e r t a i nw h i c hm e t h o dw o u l db et h em o s ts u i t a b l et oi s o l a t eD N A ，w h i c h c o u l d b e u s e

8、d f i t r t h e ri na m o l e c u l a r a n a l y s i s ，f r o mC ．n e o f o r m a n s ．T h e s em e t h o d s i n v e s t i g a t e d w e r e a s f o l l o w s ：3 ％S D S l y s i s ，c l a s s i c a l l y r i c e n z y m

9、et r e a t m e n t ，g l a s sb e a d sa n dt h eb e n z y lc h l o r i d em e t h o d s ．I ng l a s sb e a d sm e t h o d ，c e l l sw e r e b r o k e n b y v i g o r o u s l y m i x i n g w i t I l g l a s s b e a d s o

10、n a v o t o r e x ；I n 3 ％S D Sm e t h o d ，c e l l sw e r eh e a t e di n3 ％S D Se x t r a c t i o nb u f f e rc o n t a i n i n g1 0 r a MD T T f o r2 0m i n u t e s ．T h el y s a t eW a se x t r a c t e dw i t l l5 M

11、K A c a n di s o p r o p a n 0 1 ．Y i e l do f D N AW a sc a l c u l a t e df r o mt h eA 2 6 0 f o rc l e a nD N A ．T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tg l a s sb e a d sm e t h o dw a st h e m o s ts e n s i t v

12、e ，r e p r o d u c i b l e ，s i m p l ea n dc o s t —e f f e c t i v e e x t r a c t i o nm e t h o d ．( 2 ) M o l e c u l a ra n a l y s i s o fC A P 6 4g e n es e q u e n c e sf r o mf i v e s e r o t y p e s o fC ．n e

13、 o f o r m a n s ：T h e e x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ec a p s u l ep r o d u c e db y C ．n e o f o r m a n si s e s s e n t i a l f o r i t s p a t h o g e n i c i c t y ．T h e s e r o t y p i n g o

14、 fC ．n e o f o r m a n s h a s b e e np e r f o r m e di m m u n o l o g i c a l l yw i t l l a n t i s e r a a g a i n s tt h em u c o p o l y s a c c h a r i d ec a p s u l ec o m p o n e n t o f t h ey e a s t ．T h en

15、 u c l e o t i d es e q u e n c e o f C A P 6 4 g e n e sf r o m f i v es e r o t y p e so fC ．n e o f o r m a n sw e r ea n a l y z e df o rt h e i rs i m i l a r i t y ．A p p r o x i m a t e l y5 5 0 一b pg e n o m i cD

16、 N A f r a g m e n t so f t h eC A P 6 4 g e n ev c c r ea m p l i f i e df r o m e a c hi s o l a t eb yP C R ，t h eP C R p r o d u c t s f r o me a c hi s o l a t e w e r ep u r i f i e da n dc l o n e di n t o p G E M

17、 - Tv e c t o r sr e s p e c t i v e l y ，a f t e rt r a n s f e c t i n gJ M l 0 9s t r a i n ，t h er e c o m b i n a n t sw e r es c r e e n e da n di d e n t i f i e db yP C R a n d s e q u e n c e d ．Ac o m p a r i s