熱應(yīng)激對(duì)雄鼠生殖機(jī)能損傷的研究.pdf

1、以昆明雄性小白鼠為受試動(dòng)物，分別用近似陰囊溫度(33℃)、腹溫(37℃)和超高溫(42℃)三個(gè)溫度組，實(shí)施1h/d的應(yīng)激處理，以建立持續(xù)的全身熱應(yīng)激動(dòng)物模型。以小鼠精子發(fā)生過(guò)程各階段所需時(shí)間確定熱應(yīng)激持續(xù)的時(shí)間，每個(gè)溫度組又分別設(shè)四個(gè)不同熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間(8d、13d、21d和35d)。在熱應(yīng)激處理的過(guò)程中記錄小鼠應(yīng)激前后體重和肛溫的變化。分別在熱應(yīng)激持續(xù)到8d、13d、21d和35d時(shí)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察法，研究受試鼠睪丸和附睪重量及指數(shù)、

2、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和附睪精子形態(tài)學(xué)的變化；應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡分析的方法，研究睪丸和附睪組織中熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)；應(yīng)用比色法檢測(cè)睪丸和附睪組織內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)、抗氧化物酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活力或濃度的變化；應(yīng)用交配試驗(yàn)，檢測(cè)雄鼠受精能力及其致孕雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)的變化，用以揭示熱應(yīng)激對(duì)雄鼠生殖機(jī)能的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.熱應(yīng)激前后的鼠體重和肛溫變化 體重的變化

3、：受熱應(yīng)激前和后，鼠體重減輕，并且是熱應(yīng)激后的體重低于熱應(yīng)激前的體重。而受熱應(yīng)激前和后的鼠體重的差值變化是熱應(yīng)激溫度越高其越大，熱應(yīng)激次數(shù)越多其越小。 肛溫的變化：受熱應(yīng)激后，鼠肛溫上升，并且是熱應(yīng)激溫度越高，上升的幅度越明顯，但隨熱應(yīng)激次數(shù)的增加變化不顯著；而每次受熱應(yīng)激前，鼠肛溫恢復(fù)到對(duì)照組的水平。 2.熱應(yīng)激鼠體重、睪丸和附睪重量及其重量指數(shù)的變化 受熱應(yīng)激后，與對(duì)照組相比，鼠的體重、睪丸和附睪重下降，并且

4、熱應(yīng)激溫度越高越明顯。除37℃組和33℃組分別應(yīng)激8d和13d外的各組，應(yīng)激后的鼠體重均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組；除33℃組分別應(yīng)激13d和21d、37℃組應(yīng)激13d外的各組，應(yīng)激后的鼠睪丸重量均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組；除33℃組和37℃組應(yīng)激8d外的各組，應(yīng)激后的鼠附睪重量均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組。 除42℃應(yīng)激后的鼠睪丸重量指數(shù)顯著(P＜0.05)小于對(duì)照組外，其它各組的鼠睪丸重量指數(shù)與對(duì)照組間均無(wú)顯著

5、差異(P＞0.05)。而受熱應(yīng)激后，各應(yīng)激組的鼠附睪重量指數(shù)與對(duì)照組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 3.熱應(yīng)激鼠附睪尾精子的形態(tài)學(xué)變化 受熱應(yīng)激后，鼠附睪尾精子密度和精子頂體完整率呈下降趨勢(shì)，并低于對(duì)照組。除33℃組分別應(yīng)激8d、13d后的精子密度與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組。除33℃應(yīng)激后的精子頂體完整率與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0

6、.05)低于對(duì)照組。 受熱應(yīng)激后，鼠附睪尾精子畸形率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，并高于對(duì)照組。除37℃組應(yīng)激8d、33℃組分別應(yīng)激8d、13d、21d后的精子畸形率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組。 4.熱應(yīng)激鼠睪丸和附睪組織病理學(xué)變化及細(xì)胞凋亡 睪丸和附睪組織病理學(xué)變化：42℃應(yīng)激處理8d、13d后，睪丸間質(zhì)增生，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管充血；精曲細(xì)管松散，上皮排列基本不變，但

7、可見(jiàn)精原細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，腔內(nèi)精子減少。42℃應(yīng)激處理21d、35d后，睪丸間質(zhì)細(xì)胞減少，毛細(xì)血管極度擴(kuò)張；精曲細(xì)管松散，管腔增大，生精上皮變薄，不完整，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列疏松、無(wú)序，部分生精細(xì)胞從生精上皮脫落進(jìn)入曲細(xì)精管管腔，生成的精子數(shù)量減少。37℃應(yīng)激處理8d、13d后，睪丸組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化，熱應(yīng)激處理21d后，睪丸間質(zhì)毛細(xì)血管充血，偶見(jiàn)曲細(xì)精管基膜破裂。熱應(yīng)激處理35d后，曲細(xì)精管間距明顯加大，間質(zhì)細(xì)胞增大；生精上皮

8、細(xì)胞排列松散，有序排列被破壞。33℃應(yīng)激處理8d、13d和21d后，睪丸組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化，而熱應(yīng)激處理35d后，曲細(xì)精管間距加大，生精細(xì)胞排列基本有序。42℃應(yīng)激處理的鼠附睪組織，隨著熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，附睪頭部管周結(jié)締組織減少，管間間隙變大，腔內(nèi)精子減少；附睪體部的附睪管上皮細(xì)胞逐漸稀少、排列疏松，熱應(yīng)激處理35d后，附睪管壁出現(xiàn)缺損；附睪尾部的附睪管上皮細(xì)胞逐漸稀少、排列疏松，管間結(jié)締組織減少。37℃和33℃應(yīng)激處理組，鼠附睪

9、無(wú)明顯的組織學(xué)變化。 睪丸和附睪組織細(xì)胞凋亡：42℃應(yīng)激處理8d后，鼠睪丸組織切片觀察到明顯的細(xì)胞凋亡信號(hào)，凋亡主要發(fā)生在精原細(xì)胞。42℃應(yīng)激處理13d、21d和35d后，鼠睪丸組織凋亡信號(hào)逐漸減弱，并伴隨大量生精細(xì)胞的丟失。37℃和33℃應(yīng)激處理組，鼠的睪丸組織沒(méi)有明顯細(xì)胞凋亡信號(hào)。42℃應(yīng)激處理13d后，鼠附睪組織切片出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡信號(hào)，主要發(fā)生在附睪體和尾部的附睪管上皮細(xì)胞，管腔內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，而熱應(yīng)激處理21d和35

10、d后，凋亡信號(hào)減弱，并伴有附睪上皮脫落入管腔。37℃和33℃應(yīng)激處理組，鼠附睪組織沒(méi)有明顯細(xì)胞凋亡信號(hào)。 5.熱應(yīng)激鼠睪丸和附睪內(nèi)HSP70的表達(dá) 睪丸組織HSP70表達(dá)：對(duì)照組的鼠睪丸組織中HSP70呈極強(qiáng)表達(dá)(+++)；42℃應(yīng)激處理8d后的鼠睪丸組織HSP70呈弱表達(dá)(+)，主要在精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和支持細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；熱應(yīng)激處理13d和21d后的鼠睪丸組織呈極弱表達(dá)(±)；熱應(yīng)激處理35d后的鼠睪丸組織HSP70呈弱

11、表達(dá)(+)；37℃和33℃應(yīng)激處理組的鼠睪丸組織HSP70呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(++)，與熱應(yīng)激處理時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。 附睪組織HSP70表達(dá)：對(duì)照組的鼠附睪組織中HSP70呈極強(qiáng)表達(dá)(+++)；42(應(yīng)激處理8d后的鼠附睪組織HSP70呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(++)，熱應(yīng)激處理13d和21d后的鼠附睪組織HSP70呈弱表達(dá)(+)，熱應(yīng)激處理35d后的鼠附睪組織HSP70呈極弱表達(dá)(±)；37℃

12、和33℃應(yīng)激處理組的鼠附睪組織HSP70呈極強(qiáng)或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++或++)，并且其表達(dá)與熱應(yīng)激處理時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。 6.熱應(yīng)激鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度變化 受熱應(yīng)激后，鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，并且均高于對(duì)照組。對(duì)照組的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度保持穩(wěn)定。42℃和37℃應(yīng)激處理的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度

13、均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組；33℃應(yīng)激處理的鼠睪丸和附睪組織ROS活力和MDA濃度，除熱應(yīng)激處理35d后的與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其它各組均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組。 7.熱應(yīng)激鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力變化 42℃和37℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而33℃組則下降。對(duì)照組的鼠睪丸和附睪組織SOD、GSH-Px和CAT活力均保持穩(wěn)定

14、。 42℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組；37℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力，在熱應(yīng)激處理8d后均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組，在熱應(yīng)激處理13d后與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，在21d和35d后均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組；33℃組的鼠睪丸和附睪組織SOD活力，除在熱應(yīng)激處理35d后的鼠附睪組織與對(duì)照組間無(wú)顯著差異外，其它各組均顯著高于(P＜0.05)對(duì)照組。 42℃組的鼠

15、睪丸和附睪組織GSH-Px活力均低于對(duì)照組，睪丸組織GSH-Px活力在熱應(yīng)激處理8d和13d后顯著低于(P＜0.05)對(duì)照組，在熱應(yīng)激處理21d和35d后與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除熱應(yīng)激處理8d后顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組外，其它各組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；37℃組的鼠睪丸組織GSH-Px活力與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除在熱應(yīng)激處理35d后顯

16、著(P＜0.05)高于對(duì)照組外，其它各組與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；33℃組的鼠睪丸組織GSH-Px活力與對(duì)照組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而附睪組織GSH-Px活力除在熱應(yīng)激處理8d后顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組外，其它各組與對(duì)照組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 42℃組的鼠睪丸和附睪組織CAT活力均低于對(duì)照組，除熱應(yīng)激處理35d后的鼠附睪組織CAT活力與對(duì)照組間無(wú)顯著差異外，其它各組鼠睪丸和附睪組織CAT活力

17、均顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組；37℃組除熱應(yīng)激處理8d后的鼠睪丸和附睪組織CAT活力與對(duì)照組無(wú)顯著差異外(P＞0.05)，其它各組鼠的睪丸和附睪組織CAT活力均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組；33℃組的鼠睪丸和附睪組織CAT活力均顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組。 8.熱應(yīng)激后雄鼠生育能力的變化 隨著熱應(yīng)激持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，33℃和37℃組的鼠受精率提高，但明顯低于對(duì)照組；42℃組的鼠受精能力一直處于較低水平。熱應(yīng)激雄鼠