長形肉豆蔻藥用相關(guān)研究.pdf

1、目的：肉豆蔻（Mystica fragrans Houtt．）為《中國藥典》2005版收載的中藥，一般稱圓形肉豆蔻。具有溫中、下氣、消食、固腸等作用，用于心腹脹痛、虛瀉冷痢、嘔吐、宿食不消等癥。而圓形肉豆蔻肉豆蔻醚含量較高，有一定毒性，因此尋找毒性更小，作用相近的類似品顯得格外重要。所以本研究在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，首次對長形肉豆蔻（Myristica argentea Warb．）進(jìn)行全面深入的研究，制定炮制工藝，

2、對其化學(xué)成分與圓形肉豆蔻進(jìn)行比較研究，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)一步考察長形肉豆蔻揮發(fā)油的制劑和長形肉豆蔻揮發(fā)油對人癌細(xì)胞體外增殖的影響等藥理作用，以期擴(kuò)大藥源，為長形肉豆蔻的研究開發(fā)和臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)，為中藥現(xiàn)代化研究做出有益的嘗試。
　　 材料與方法：
　　 1．藥材：圓形肉豆蔻藥材購于沈陽市藥材公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻（Mystica fragrans Houtt．）的干燥成熟種仁。長形

3、肉豆蔻藥材購于安徽毫州，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為肉豆蔻科植物長形肉豆蔻（Mystica argentea． Warb．）的干燥成熟種仁。
　　 2．方法：通過常規(guī)觀察確定其外觀性狀。通過薄層色譜法及高效液相色譜法對兩種肉豆蔻揮發(fā)油含量及成分進(jìn)行比較分析。利用現(xiàn)代層析技術(shù)和分離方法對長形肉豆蔻的揮發(fā)油和乙醇提取物進(jìn)行了分離。采用GC/MS方法分析長形肉豆蔻和圓形肉豆蔻揮發(fā)油。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定樣

4、品中多種元素的含量。通過對兩種肉豆蔻的面裹煨、滑石粉煨、麩煨、泡后麩煨四種炮制方法研究確認(rèn)長形肉豆蔻的炮制方法及采用綜合加權(quán)評分的方法確定其工藝。參考中國藥典2005年版一部肉豆蔻標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合三個市售地長形肉豆蔻及麩煨長形肉豆蔻的質(zhì)量研究結(jié)果提出長形肉豆蔻及麩煨長形肉豆蔻的標(biāo)準(zhǔn)。為使長形肉豆蔻揮發(fā)油發(fā)揮效用，根據(jù)藥物本身的性質(zhì)、劑型和工藝的要求，以自乳化系統(tǒng)為載體，將其制成軟膠囊，用總體液平衡反向透析法對長形肉豆蔻揮發(fā)油自乳化軟膠囊的體

5、外溶出過程進(jìn)行考察。為了比較長形肉豆蔻及圓形肉豆蔻的藥用價值，本文通過兩種肉豆蔻揮發(fā)油直接作用于腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行體外抗腫瘤試驗。
　　 結(jié)果：
　　 1．長形肉豆蔻和圓形肉豆蔻藥材外觀明顯不同，因為長形肉豆蔻的長度為3～4 cm，而圓形肉豆蔻長度為2～3cm。
　　 2．兩者揮發(fā)油含量及其油中成分的含量有較大差異，長形肉豆蔻揮發(fā)油含量低于圓形肉豆蔻，其揮發(fā)油中止瀉成分甲基丁香酚和異甲基丁香酚的含量也略微低于圓形肉豆

6、蔻，毒性成分黃樟醚高于圓形肉豆蔻，而肉豆蔻醚在長形肉豆蔻中不易被液相檢測出，含量甚少。經(jīng)提取分離共得到13個化合物，通過經(jīng)典的化學(xué)方法和波譜學(xué)技術(shù)鑒定了結(jié)構(gòu)，為木脂素類化合物。其中，6個化合物為種內(nèi)首次分離，1個為科內(nèi)首次分離。采用GC/MS方法分析長形肉豆蔻和圓形肉豆蔻揮發(fā)油，鑒定出長形肉豆蔻生品32個化合物，其炮制品29個化合物，減少了α-蒎烯、α，α，4-三甲基苯甲醇、3一甲基-6-異丙基-2環(huán)己烯-1-醇3種化合物。圓形肉豆蔻生

7、品35個化合物，其炮制品36個化合物，增加的化合物為乙酸龍腦酯。兩種肉豆蔻在炮制前后無機(jī)元素的含量情況：Mg、Ca、Fe、Na的含量在炮制后有所升高；K有所降低。而且圓形肉豆蔻中的必需元素含量比長形肉豆蔻中的含量多。兩種肉豆蔻炮制前后的有毒有害重金屬元素含量基本沒有變化。
　　 3．通過對兩種肉豆蔻的四種炮制方法研究，可以看出兩種肉豆蔻的泡后麩煨法優(yōu)于其他方法，而長形肉豆蔻含的肉豆蔻醚很少，所以初步認(rèn)為長形肉豆蔻的毒性小于圓形肉

8、豆蔻。進(jìn)一步對長形肉豆蔻的泡后麩煨工藝研究，在長形肉豆蔻炮制工藝中，選用L9（34）正交表設(shè)計實驗，以止瀉有效成分甲基丁香酚和異甲基丁香酚的含量為主要指標(biāo)，以黃樟醚為次要指標(biāo)，進(jìn)行綜合評分，優(yōu)選出長形肉豆蔻最佳炮制工藝為加水浸泡6小時，麩煨溫度160～170℃，麩煨時間25min，藥麩比100：40。
　　 4．本研究完成了長形肉豆蔻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及麩煨長形肉豆蔻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及起草說明。建立了長形肉豆蔻中甲基丁香酚、異甲基丁香酚、黃樟醚的

9、含量測定方法。并進(jìn)行了顯微鑒別、薄層鑒別、揮發(fā)油、水分、總灰分、酸不溶性灰分等測定。揮發(fā)油照揮發(fā)油測定法（中國藥典2005附錄XD）測定，不得少于3.0％。水分照水分測定法（中國藥典2005附錄Ⅸ H第二法）測定，不得過6.0％?？偦曳终湛偦曳譁y定法（中國藥典2005附錄Ⅸ K）測定，不得過5.0％。酸不溶性灰分照酸溶性灰分測定法（中國藥典2005附錄Ⅸ K）測定，不得過1.0％
　　 5．長形肉豆蔻揮發(fā)油，25℃在油酸乙酯中平

10、衡溶解度較大；在Tween80等親水性表面活性劑和Transcutol P等助溶劑中的平衡溶解度較大。親脂性較好。確定了一個最優(yōu)的油、表面活性劑和助溶劑配伍，即油相油酸乙酯、非離子表面活性劑吐溫-80、助溶劑Transcutol P。溫度、溶液的流動形態(tài)、pH和體積等外在因素對自乳化效率的影響實驗結(jié)果顯示，溶液體積對自乳化性能無顯著性影響；在一定范圍內(nèi)升高溫度、加大攪拌速度可以縮短體系的自乳化時間；在水、0.1 mol·L-1 HC1、

11、pH7.4 PBS三種介質(zhì)中，0.1 mol·L-1 HC1使自乳化時間稍微延長。SEDDS（自乳化藥物傳遞系統(tǒng)）中，藥物的加入、非離子表面活性劑和助溶劑的比例都對SEDDS的乳化性能有影響。以油酸乙酯、吐溫-80、Transcutol P作為油相、乳化劑、助溶劑繪制的假三元相圖，同時根據(jù)乳化后的粒徑大小及自乳化效率，確定了一個最優(yōu)處方比例：長形肉豆蔻揮發(fā)油：油酸乙酯：吐溫-80：Transcutol P（5：45：50：5）（w）。用

12、總體液平衡反向透析法對長形肉豆蔻揮發(fā)油自乳化軟膠囊的體外溶出過程進(jìn)行了初步考察，其溶出曲線最符合Hixson-Crowell經(jīng)驗方程?？瞻譙EDDS和長形肉豆蔻揮發(fā)油SEDDS的動電電位均為0 mV，但長形肉豆蔻揮發(fā)油SEDDS的粘度大于空白SEDDS。同時，藥物的加入使得體系的自乳化區(qū)域明顯減小，而乳化后所得乳劑的油水間界面張力降低，自乳化區(qū)內(nèi)各組成的乳化效率增強(qiáng)，所得乳劑粒徑減小。長形肉豆蔻揮發(fā)油SEDDS的穩(wěn)定性考察試驗表明，SE

13、DDS遇強(qiáng)光照射會導(dǎo)致長形肉豆蔻揮發(fā)油含量降低，故須避光保存；在避光留樣試驗中，長形肉豆蔻揮發(fā)油SEDDS的外觀、藥物含量、乳化速度、乳化后所得乳劑的平均粒徑等各項指標(biāo)基本無變化，穩(wěn)定性良好。長形肉豆蔻揮發(fā)油SEDDS經(jīng)溶液以不同比例稀釋后，4h內(nèi)溶液穩(wěn)定，未見藥物析出，保證了藥物在動物體內(nèi)的生物利用度。
　　 6．主要研究考察了兩種肉豆蔻揮發(fā)油對人癌細(xì)胞HepG-2、SGC-7901、KB和KB的體外增值抑制作用，結(jié)果顯示：圓