苡仁提取物對(duì)中波紫外線照射后HaCaT細(xì)胞水通道蛋白3表達(dá)的調(diào)節(jié)及意義.pdf

1、皮膚衰老是內(nèi)源性因素和外源性環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。紫外線是導(dǎo)致皮膚老化的最重要的外源性因素。光老化臨床表現(xiàn)為皮膚干燥、皺紋、變薄、色素沉著及各種皮膚良、惡性腫瘤，如日光性角化病、鱗狀細(xì)胞癌等，其中尤以皮膚干燥和皺紋最早發(fā)生。日光中紫外線主要由中波紫外線(ultraviolet B，UVB，290-320nm)和長(zhǎng)波紫外線構(gòu)成，前者大部分被表皮吸收，主要作用于角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)，刺激前炎癥細(xì)胞因子釋放，降低水通道蛋白(aquapori

2、n)的表達(dá)，致皮膚干燥脫水以及一系列的光老化表現(xiàn)。 KC不僅維持皮膚結(jié)構(gòu)和功能的完整，而且可以分泌多種細(xì)胞因子。未受紫外線輻射的KC，細(xì)胞因子產(chǎn)生極少。當(dāng)UVB照射后，KC產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，其中IL-1α等炎癥介質(zhì)還與UVB照射有劑量依賴性關(guān)系。UVB照射后，KC aquaporin3的表達(dá)降低，引起皮膚脫水干燥。細(xì)胞因子和aquaporin3共同對(duì)皮膚光老化的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。 水通道蛋白(aquapo

3、rins，AQPs)是一組與水、甘油及部分小分子物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白亞型，按順序分別命名為AQP0～12，它們構(gòu)成AQPs家族。水通蛋白中AQP1、AQP2、、AQP4、AQP5和AQP8主要參與水的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)；AQP3、AQP7、AQP9和AQP10主要參于水和非極性小分子物質(zhì)如甘油、尿素等的轉(zhuǎn)運(yùn)。1994年Ishibashi等發(fā)現(xiàn)和鑒定了AQP3。AQP3表達(dá)于包括皮膚在內(nèi)的多種組織和器官。正

4、常表皮KC僅在基底細(xì)胞層表達(dá)AQP3。AQP3為上皮細(xì)胞膜提供一個(gè)孔道，保持細(xì)胞內(nèi)滲透壓和細(xì)胞容積，在水的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用。AQP3的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)功能對(duì)皮膚的水合作用，彈性保持及損傷后的修復(fù)功能起著關(guān)鍵性作用。AQPs還參與了多種其他病理生理過(guò)程，如上皮系統(tǒng)的通道作用(水分子及甘油、尿素等其它小分子)、腦水腫、細(xì)胞遷移、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用等。 植物提取物尤其中草藥，基于其含有的多種生物活性成分，如多糖、黃酮、微量元素、維生素、激素及類激

5、素等，在延緩皮膚衰老、抵抗光老化方面有確實(shí)的療效。康萊特(KLT)是中藥苡仁采用臨界萃取技術(shù)獲得的油狀物的乳化劑，臨床及試驗(yàn)研究證實(shí)其具有抗腫瘤作用。近來(lái)發(fā)現(xiàn)KLT還可以抑制環(huán)氧脂合酶以及核因子(NF—κB)的表達(dá)，進(jìn)而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)。 本研究以體外培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)為靶細(xì)胞。觀察UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3表達(dá)的變化。觀察KLT對(duì)HaCaT細(xì)胞在UVB照射后的AQP3表達(dá)變化的

6、調(diào)節(jié)。同時(shí)觀察IL-1α作用后HaCaT細(xì)胞AQP3表達(dá)水平的變化。初步探討KLT抗光老化的作用機(jī)理和臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法： 一、細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。 二、MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 檢測(cè)KLT對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖抑制的影響。 三、實(shí)時(shí)定量熒光RT-PCR檢測(cè) (一)檢

7、測(cè)IL-1α處理后，HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)； (二)檢測(cè)UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3mRNA的表達(dá)； (三)檢測(cè)KLT對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA的表達(dá)的影響。 四、Western blot分析 (一)檢測(cè)IL-1α處理后，HaCaT細(xì)胞AQP3蛋白的表達(dá)； (二)檢測(cè)UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3蛋白的表達(dá)； (三)檢測(cè)KLT對(duì)UVB照射后Ha

8、CaT細(xì)胞AQP3蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 一、MTT結(jié)果 KLT120μl/ml時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞沒(méi)有明顯的增殖抑制作用(p>0.05)。 二、RT-PCR結(jié)果 (一)UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA水平明顯下調(diào)；隨UVB劑量增加該下調(diào)作用增強(qiáng)；UVB照射后6h開(kāi)始下降，24 h小時(shí)達(dá)到高峰(p均<0.001)。 (二)KLT作用于UVB照射后的HaCaT細(xì)胞，能夠明顯上調(diào)

9、AQP3 mRNA水平，并具有劑量—效應(yīng)關(guān)系；該上調(diào)作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)(p<0.0001)；KLT和KLT基質(zhì)的上調(diào)作用的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(p<0.001)。 (三)IL-1α作用后HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA水平明顯下調(diào)；并具有劑量—效應(yīng)關(guān)系；作用后12 h達(dá)到高峰(p<0.001)。 三、Western blot結(jié)果 (一)UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3水平明顯下調(diào)；隨UVB劑量增加而

10、增強(qiáng)；UVB照射后12 h達(dá)到高峰。 (二)KLT作用于UVB照射后HaCaT，能夠明顯上調(diào)AQP3水平，并具有劑量—效應(yīng)關(guān)系；該上調(diào)作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；和KLT基質(zhì)的上調(diào)作用的比較有明顯差異。 (三)IL-1α作用后HaCaT細(xì)胞AQP3水平明顯下調(diào)；并具有劑量—效應(yīng)關(guān)系；隨時(shí)間延長(zhǎng)，作用后6h達(dá)到高峰。 結(jié)論： 一、IL-1α可以下調(diào)HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并具有劑