葡萄籽提取物原花青素對紫外線照射皮膚的防護作用及機制研究.pdf

1、前言：大量的紫外線(ultraviolet,UV)照射可導(dǎo)致皮膚光損傷、免疫抑制、甚至皮膚癌的發(fā)生。皮膚組織病理學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)日曬傷細胞、p53突變的細胞、朗格漢斯細胞減少或衰竭。同時UV照射可以加速皮膚光老化的過程,光老化表現(xiàn)為真皮膠原降解增多,彈性纖維變性,從而產(chǎn)生皺紋和皮膚彈性下降。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類重要的蛋白水解酶類,通過水解、破壞細胞外基質(zhì),引起皮膚老化的臨床表現(xiàn)

2、,其中MMP-1在其中起著尤為重要的作用。研究證實MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Mitogen activated kinase signal pathway)在調(diào)控細胞生長、MMP的表達及Ⅰ型前膠原的合成方面起著非常重要的作用。
　　 綠茶、石榴、西蘭花等植物提取物基于其含有的多種生物活性成分如多糖、黃酮、微量元素、維生素、激素及類激素等成分,在延緩皮膚衰老、抵抗光老化方面經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有一定的療效。葡萄籽提取物原花青素(Grape S

3、eedProanthocyanidin Extract,GSPE)是植物多酚類物質(zhì),從葡萄籽中提取而來,含低聚原花青素達95％以上,是一種天然抗氧化物質(zhì),近年來備受關(guān)注,在心血管、抗腫瘤、抗衰老方面已經(jīng)開展了大量的研究,目前尚無GSPE防護紫外線照射皮膚方面的研究。本研究分別以人體及成纖維細胞為靶細胞,觀察GSPE對紫外線照射皮膚日曬傷細胞、朗格漢斯細胞、突變型p53和MMP-1表達及MAPK信號通路的影響,初步探討GSPE的應(yīng)用價值和

4、可能的作用機制。
　　 方法：
　　 本實驗包括人體實驗和細胞學(xué)實驗兩個部分。
　　 人體實驗招募十名志愿者,以10名志愿者的背部作為受試部位,共分為四組(四個皮膚區(qū)域):其中G1組不作任何處理;G2組連續(xù)三天單純接受2倍最小紅斑量(Minimal Erythema Dose,MED)值日光模擬器連續(xù)照射;G3組先外用基質(zhì)處理,30分鐘后再接受2倍MED值UVB照射;G4組局部先外用含GSPE的樣品,30分鐘后再

5、接受2倍MED值UVB照射;連續(xù)3天均同樣處理。經(jīng)以上處理后照相,皮膚活檢進行HE染色和免疫組織化學(xué)染色,觀察表皮厚度的變化,測定皮膚損傷和免疫方面的相關(guān)指標:日曬傷細胞、p53及朗格漢斯細胞與皮膚老化相關(guān)指標-MMP-1的表達,判定皮膚接受2MED的紫外線照射后皮膚損傷的情況及GSPE對皮膚損傷的影響。
　　 細胞學(xué)實驗中,實驗分為四組:正常對照組、加藥組(在培養(yǎng)基中加GSPE)、單純紫外線照射組,加藥(在培養(yǎng)基中加GSPE)

6、+紫外線照射處理組。紫外線照射采用長波紫外線(ultraviolet A,UVA)光源照射3-5代人體皮膚成纖維細胞,連續(xù)照射3天,總照射劑量為5-7J/cm2,實驗組采用GSPE加藥干預(yù)后再進行照射。CCK-8法檢測紫外線照射劑量和GSPE濃度對細胞增殖活性的影響,β-半乳糖苷酶染色判定細胞的老化程度。蛋白印跡法(Western blot法)檢測MMP-1表達和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK、JNK和p38磷酸化蛋白和總蛋白的表達情況。

7、
　　 結(jié)果：
　　 1.組織病理結(jié)果顯示:皮膚經(jīng)2MED紫外線照射后,表皮明顯變厚,表皮中日曬傷細胞明顯增多,外用GSPE的皮膚再接受照射的皮膚顯著變薄,表皮中日曬傷細胞顯著減少。
　　 2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,皮膚經(jīng)2MED紫外線照射后,突變型p53陽性細胞明顯增多,朗格漢斯細胞明顯減少,MMP-1表達升高。接受GSPE外用后的皮膚p53陽性細胞明顯減少,MMP-1表達下降,同時朗格漢斯細胞的數(shù)目接近正常。

8、以上變化經(jīng)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.GSPE的紫外線吸收峰值為275nm左右,SPF值為2,說明GSPE尚具有一定的吸收紫外線作用。
　　 4.細胞β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示紫外線照射后細胞老化明顯,而加用GSPE干預(yù)后能夠逆轉(zhuǎn)這一老化過程。
　　 5.免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,細胞經(jīng)紫外線照射后,MMP-1表達增強,MMP-1表達積分明顯增加;加用GSPE干預(yù)后,MMP-1表達明顯減弱,MMP-1表達積分明

9、顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 6.Western blot結(jié)果顯示經(jīng)紫外線照射后的細胞,磷酸化ERK1/2、JNK1/2及p38表達均明顯上調(diào),而加用GSPE培養(yǎng)的細胞磷酸化ERK1/2表達明顯減弱,JNK1/2及p38表達無明顯變化,說明GSPE可能通過抑制MAPK/ERK信號通路磷酸化而起作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.GSPE可以減少紫外線損傷后日曬傷細胞的生成,能抑制紫外線損傷皮膚引起的突變型p53的