Wnt4信號在胸腺增齡性萎縮過程中的作用研究.pdf

1、目的:
　　通過探討隨年齡增長小鼠胸腺內(nèi)細胞增殖、凋亡的動態(tài)變化趨勢，以及在此過程中Wnt4信號的變化，并研究增強Wnt4信號對體外培養(yǎng)的胸腺上皮細胞增殖和凋亡的影響，進而了解Wnt4信號在胸腺增齡性萎縮過程中的分子調(diào)節(jié)機制。為進一步認識胸腺與老化，提高老齡人口健康水平提供科學的理論依據(jù)。
　　方法
　　1、小鼠自然老化模型
　　購買時1月齡C57BL/6小鼠，按照實驗設(shè)計飼養(yǎng)到不同月齡，每組6～8只，雌雄各半。

2、所有小鼠均在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心動物部SPF級室飼養(yǎng)。
　　2、分離純化胸腺細胞和基質(zhì)細胞
　　(1)將胸腺組織在無菌PBS中漂洗幾遍，然后用含膠原酶Ⅱ，胰酶和DNaseⅠ酶的消化液37℃消化30min。
　　(2)細胞懸液首先與偶聯(lián)有小鼠CD45抗體的磁珠(Miltenyi)進行孵育，然后經(jīng)有磁性的LS柱吸附，最后用MACSbuffer洗脫。CD45為淋巴細胞特異性表達，因此陰性分選到的是胸腺基質(zhì)細胞

3、，而陽性吸附的則為胸腺細胞。
　　3、檢測不同年齡階段TECs和各胸腺細胞亞群的增殖和凋亡水平
　　(1)增殖水平的測定:C57BL/6小鼠腹腔注射Edu。24h后收集胸腺組織并制備單細胞懸液，然后進行磁珠分選。按照實驗設(shè)計，胸腺細胞進行CD4和CD8抗體標記，胸腺基質(zhì)細胞進行EpCAM1抗體標記。然后按照Edu檢測試劑盒進行細胞增殖檢測。
　　(2)凋亡分析:首先使用磁珠分選法分離純化TSCs和胸腺細胞，進行細胞表面

4、抗體標記后按照細胞凋亡檢測試劑盒說明進行AnnexinⅤ-FITC熒光標記，同時PI標記用于去除死細胞。
　　4、檢測不同年齡TSCs和胸腺細胞Wnt4信號相關(guān)基因表達水平
　　分離不同年齡階段TSCs和胸腺細胞后用TRIzol試劑提取出總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitate realtime-PCR)，檢測隨年齡增長，TSCs和胸腺細胞中Wnt4、FoxN1、Bcl-xL基因

5、表達水平的變化。
　　5、檢測外源Wnt4信號對MTEC1細胞增殖和凋亡的影響
　　(1)凋亡影響:對照組（僅細胞培養(yǎng)液）;Dex實驗組;Dex+Wnt4實驗組。培養(yǎng)48h后，AnnexinⅤ法檢測各組MTEC1細胞凋亡水平。
　　(2)增殖影響:MTEC1細胞分別用LiCl刺激(24h)或外源重組Wnt4蛋白刺激(16h)，Edu法測細胞增殖變化。
　　結(jié)果:
　　1、隨年齡增長，胸腺老化的表現(xiàn)以及Wnt

6、4信號的變化
　　隨年齡增長，胸腺體積逐漸縮小;胸腺內(nèi)各種細胞數(shù)量（包括胸腺總細胞數(shù)，TECs數(shù)，胸腺細胞總數(shù)以及CD4、CD8、DN、DP亞群細胞數(shù)）也隨年齡增長而明顯減少。同時隨年齡增長，TSCs和胸腺細胞中Wnt4信號相關(guān)基因Wnt4、FoxN1和Bcl-xL表達量都有所下降。并且在胸腺中Wnt4蛋白主要是由TSCs所分泌的。
　　2、隨年齡增長，TECs和各胸腺細胞亞群增殖及凋亡水平的變化
　　Edu檢測結(jié)果表

7、明隨年齡增長，TECs和各胸腺細胞亞群的增殖水平持續(xù)下降。另外，細胞凋亡檢測結(jié)果表明老年小鼠胸腺內(nèi)各種細胞(包括TECs、CD4、CD8、DP、DN、ETP)的凋亡比例都明顯增高。
　　3、外源性Wnt4信號對MTEC1細胞增殖和凋亡的影響
　　(1)相比較對照組，Dex作用下MTEC1細胞凋亡比例增加，而在同時添加Dex和外源Wnt4蛋白的培養(yǎng)液中，MTEC1細胞凋亡比例可維持在正常水平，說明外源性Wnt4信號能有效的減輕

8、Dex對MTEC1細胞的凋亡誘導作用。
　　(2)通過體外添加LiCl和外源Wnt4蛋白的方法激活Wnt4信號，流式分析結(jié)果顯示MTEC1細胞增殖比例增加約10％。可見，激活Wnt4信號能夠有效的促進MTEC1細胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　在胸腺增齡性萎縮過程中，Wnt4信號的改變是引起細胞增殖和凋亡失衡的一個原因。Wnt4信號能有效的促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，而隨年齡增長，胸腙內(nèi)細胞分泌Wnt4蛋白能力下降，影響下