WNT4信號(hào)通路在PAX2基因誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中作用機(jī)制研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis，RIF)是慢性腎功能衰竭進(jìn)行性發(fā)展過程中的始動(dòng)因素，是慢性腎臟疾病發(fā)展至終末腎病的共同途徑。腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵步驟是腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)即腎小管上皮細(xì)胞喪失上皮細(xì)胞表型的同時(shí)獲取成纖維細(xì)胞特征。越來越多的證據(jù)表明EMT在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
　　 配對(duì)盒基

2、因2(Paired Box2，PAX2)編碼核轉(zhuǎn)錄因子，是腎臟胚胎發(fā)育過程中誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵性發(fā)育基因之一，在前、中、后腎發(fā)育的全過程中表達(dá)，參與胚胎腎臟各個(gè)發(fā)育階段的調(diào)控，成熟腎單位其表達(dá)消失。近年來發(fā)現(xiàn)，PAX2基因在腎小球疾病腎小管上皮細(xì)胞有不同程度表達(dá)，認(rèn)為PAX2回歸表達(dá)可能導(dǎo)致EMT，進(jìn)而出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化。由于體內(nèi)作用因素復(fù)雜，存在諸多信號(hào)通路、信號(hào)分子及細(xì)胞因子，PAX2是否能直接誘導(dǎo)EMT至今尚無研究。

3、r>　　 以往對(duì)EMT機(jī)制的研究主要有TGFβ1、integrin/ILK、WNT/β-catenin等通路。近年來WNT/β-catenin通路在胚胎器官發(fā)育過程中研究較為深入，該項(xiàng)研究顯示:PAX2通過激活WNT4通路可促進(jìn)S-形小管的形成及誘導(dǎo)后腎間充質(zhì)細(xì)胞聚集并分化為上皮細(xì)胞，敲減PAX2將導(dǎo)致S-形小管的形成不良，間充質(zhì)細(xì)胞聚集障礙而停止分化，故認(rèn)為WNT4是PAX2的靶基因。在正常成熟大鼠腎臟中WNT4處于失活狀態(tài)，在腎間

4、質(zhì)纖維化模型大鼠腎臟中WNT4明顯升高且活性增強(qiáng)，證實(shí)WNT4通過調(diào)控EMT，促進(jìn)腎纖維化作用，將WNT阻斷后，腎臟纖維化程度減輕。但PAX2在腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎臟重新表達(dá)后是否亦通過激活WNT4通路調(diào)控EMT至今尚無研究。
　　 本課題探討了WNT4信號(hào)通路在PAX2誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用及其機(jī)制。通過構(gòu)建高表達(dá)PAX2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞，觀察PAX2是否可以直接誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT;應(yīng)用W

5、NT通路阻斷劑阻斷WNT通路，探討PAX2是否通過WNT通路調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞EMT;應(yīng)用WNT4siRNA沉默WNT4基因探討WNT4基因是否為PAX2誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞EMT的調(diào)控基因。
　　 材料和方法：
　　 一、WNT4信號(hào)通路在PAX2誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用
　　 制備單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateralurcteral obstructinn，UUO)大鼠模型，提取造模后第2

6、1天腎組織mRNA，擴(kuò)增大鼠PAX2全長編碼序列，將該目的基因與真核表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒（含Neo抗性基因）進(jìn)行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，以PCR方法鑒定陽性克隆，并進(jìn)行測(cè)序和分析比對(duì)，獲得融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體pEGFP-PAX2。通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pEGFP-PAX2轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)PAX2腎小管上皮細(xì)胞系。
　　 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為三組:對(duì)照組，空載組及

7、穩(wěn)轉(zhuǎn)組。
　　 應(yīng)用熒光顯微鏡、Western blot和Realtime PCR法進(jìn)行轉(zhuǎn)染鑒定。應(yīng)用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。采用免疫熒光，Western blot和Realtime PCR檢測(cè)三組細(xì)胞表型標(biāo)志物E鈣黏蛋白（E-cadherin）和α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)蛋白和mRNA的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移率。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲程度。采用免疫熒光，免疫組化，Western blot及Realti

8、me PCR檢測(cè)WNT4及β-catenin蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 二、WIF-1阻斷WNT通路對(duì)PAX2誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化作用的影響
　　 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組:WIF-1（5ug/ml）;WIF-1(10ug/ml);WIF-1(15ug/ml);PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組。
　　 應(yīng)用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫熒光方法檢測(cè)β-catenin蛋白和mRNA的

9、表達(dá)。
　　 應(yīng)用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移率。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲程度。應(yīng)用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 三、WNT4基因沉默對(duì)PAX2誘導(dǎo)的腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化作用的影響
　　 根據(jù)Geenbank設(shè)計(jì)大鼠WNT4靶向性siRNA:siR

10、NA1 siRNA2 siRNA3，用脂質(zhì)體2000分別將WNT4 siRNA轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2腎小管上皮細(xì)胞系，應(yīng)用Western blot和RT-PCR方法篩選最佳沉默位點(diǎn)。
　　 應(yīng)用Western blot方法進(jìn)行WNT4沉默鑒定。
　　 將最佳沉默位點(diǎn)WNT4 siRNA轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2腎小管上皮細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為五組:穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組，WNT4 siRNA24h組，WNT4 siRNA48h組，WNT4si

11、RNA72h組，WNT4 siRNA96h組。
　　 應(yīng)用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR和免疫熒光方法檢測(cè)β—catenin蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 應(yīng)用Western blot，RT-PCR，Realtime PCR，免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin和α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移率。應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲程度。應(yīng)用相

12、差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 一、WNT4信號(hào)通路在PAX2誘導(dǎo)正常腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用
　　 重組質(zhì)粒pEGFP-PAX2鑒定:所得的PCR片段與預(yù)期大小1200 bp左右一致。將陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast分析，證實(shí)所插入的目的片段與genebank檢索的大鼠PAX2的cDNA序列100％匹配，說明PCR過程無突變發(fā)生。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pEGFP-PAX2構(gòu)建成功。

13、>　　 轉(zhuǎn)染鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組和空載組綠色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組的PAX2蛋白表達(dá)明顯高于空載組及對(duì)照組(P＜0.05); RealtimePCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組的PAX2基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，以上結(jié)果證明PAX2轉(zhuǎn)染成功。
　　 轉(zhuǎn)分化作用觀察相差顯微鏡下觀察:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組腎小管上皮細(xì)胞的形態(tài)較對(duì)照組及空載組伸長;細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)檢測(cè):免疫熒光結(jié)果顯示，穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞E-

14、cadherin染色較空載組及對(duì)照組明顯減弱;α-SMA染色較空載組及對(duì)照組明顯增強(qiáng);Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組的E-cadherin明顯低于空載組及對(duì)照組(P＜0.05)，α-SMA明顯高于空載組及對(duì)照組(P＜0.05);Realtime PCR結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組的E-cadherin基因明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，α-SMA基因明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PAX2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后1

15、0h及18h細(xì)胞遷移率較對(duì)照組及空載組明顯增加(P＜0.05);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PAX2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲程度較對(duì)照組及空載組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。以上結(jié)果證明PAX2使正常腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)EMT。
　　 PAX2轉(zhuǎn)染后對(duì)WNT4通路作用免疫組化結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞WNT4染色較空載組及空白對(duì)照組明顯增強(qiáng);免疫熒光結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組細(xì)胞β-catenin染色較空載組及空白對(duì)照組明顯增強(qiáng);Western blo

16、t檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組的WNT4及β-catenin明顯高于空載組及空白對(duì)照組(P＜0.05);Realtime PCR結(jié)果顯示:穩(wěn)轉(zhuǎn)組的WNT4及β-catenin基因明顯高于空載組及空白對(duì)照組(P＜0.05)。以上結(jié)果證明PAX2可能激活了WNT4通路。
　　 二、WIF-1阻斷WNT通路對(duì)PAX2誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化作用的影響
　　 WIF-1對(duì)PAX2激活的WNT通路的阻斷作用Western bl

17、ot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組β-catenin蛋白較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減少，WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結(jié)果顯示:WIF-1（5ug/ml）、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組β-catenin mRNA較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減少，WIF-1（15ug/ml）組最明顯(

18、P＜0.05);免疫熒光結(jié)果顯示:WIF-1（10ug/ml）和WIF-1(15ug/ml)組β-catenin染色均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減弱，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯。以上結(jié)果證明WIF-1阻斷了WNT通路。
　　 轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)作用觀察Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組E-cadherin蛋白表達(dá)均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組

19、增多，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05)。WIF-1（5ug/ml）、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1（15ug/ml）組α-SMA蛋白表達(dá)均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減少，其中WIF-1（15ug/ml）組最明顯(P＜0.05);RT-PCR及Realtime PCR
　　 結(jié)果顯示:WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)組E-cadherinmRNA表達(dá)

20、均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組增多，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯(P＜0.05)。WIF-1(5ug/ml)、WIF-1(10ug/ml)及WIF-1(15ug/ml)組α-SMA mRNA表達(dá)均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減少，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯(P＜0.05);免疫熒光結(jié)果顯示:WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組E-cadherin染色均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組增強(qiáng)，其中WIF-1（15ug/

21、ml）組最明顯;WIF-1（10ug/ml）及WIF-1（15ug/ml）組α-SMA染色均較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減弱，其中WIF-1(15ug/ml)組最明顯;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:WIF-1（15ug/ml）組10h及18h細(xì)胞遷移率較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組明顯減弱(P＜0.05);Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:WIF-1(15ug/ml)組細(xì)胞侵襲程度較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減弱(P＜0.05);相差顯微鏡下觀察:WIF-1(15ug/m

22、l)組細(xì)胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞變圓，接近正常腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)。以上結(jié)果證明阻斷WNT通路后使PAX2誘導(dǎo)的EMT的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)。
　　 三、WNT4基因沉默對(duì)PAX2誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化作用的影響
　　 WNT4基因沉默鑒定將WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4 siRNA3分別轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞。Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:WNT4 siRNA1，WN

23、T4siRNA2和WNT4 siRNA3三組WNT4蛋白表達(dá)較對(duì)照組均降低，以WNT4 siRNA3最明顯(P＜0.05);RT-PCR結(jié)果顯示:WNT4 siRNA1，WNT4 siRNA2和WNT4siRNA3三組WNT4 mRNA較對(duì)照組表達(dá)均降低，以WNT4 siRNA3最明顯(P＜0.05)。以上結(jié)果證明WNT4 siRNA3沉默效率較高，故下面實(shí)驗(yàn)均選擇WNT4siRNA3行相關(guān)檢測(cè)。
　　 WNT4 siRNA3轉(zhuǎn)

24、染鑒定將WNT4 siRNA3轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PAX2細(xì)胞，分別于24h、48h、72h及96h收集細(xì)胞。Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:沉默24h、48h、72h及96h后，WNT4蛋白表達(dá)較未沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組均降低，以72h最明顯（P＜0.05）。
　　 WNT4基因沉默對(duì)PAX2激活的WNT4通路的阻斷作用Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin蛋白較未沉默穩(wěn)

25、轉(zhuǎn)對(duì)照組減少，72h組最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結(jié)果顯示:WNT4沉默24h、48h、72h及96h后，β-catenin mRNA較未沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組減少，72h組最明顯(P＜0.05);免疫熒光結(jié)果顯示:沉默72 h組β-catenin染色較未沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組減弱。以上結(jié)果證明沉默WNT4基因阻斷了WNT4通路。
　　 轉(zhuǎn)分化逆轉(zhuǎn)作用觀察Western blot檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示:沉默24h，4

26、8h，72h及96h后，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的E-cadherin蛋白表達(dá)均較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組增多，72h組增多最明顯(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的α-SMA蛋白表達(dá)均較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組減少，72h組減少最明顯(P＜0.05);RT-PCR和Realtime PCR結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的E-cadherin mRNA表達(dá)均較穩(wěn)轉(zhuǎn)PAX2細(xì)胞組上調(diào)，72h組上調(diào)最明顯(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的α-SMA mRNA表達(dá)均較穩(wěn)轉(zhuǎn)PAX2細(xì)胞組下

27、調(diào)，72h組下調(diào)最明顯(P＜0.05);免疫熒光結(jié)果顯示:沉默72 h組E-cadherin染色均較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組增強(qiáng)，α-SMA染色均較穩(wěn)轉(zhuǎn)對(duì)照組減弱;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:沉默72h組10h及18h細(xì)胞遷移率較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組明顯減弱(P＜0.05);Transwell
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:沉默72h組細(xì)胞侵襲程度較PAX2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組減弱(P＜0.05);相差顯微鏡下觀察沉默72h組細(xì)胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞變圓，接近正常腎小管上皮