醉馬草內(nèi)生真菌與宿主種帶真菌、根際微生物的互作及其進(jìn)化研究.pdf

1、禾草內(nèi)生真菌(Epichlo? spp.)常與早熟禾亞科(Pooideae)冷季型禾草形成一類(lèi)較為特殊的禾草-內(nèi)生真菌互惠共生體。醉馬草-內(nèi)生真菌共生體(Achnatherum inebrians-Epichlo? sp.)是國(guó)際上研究較多的三大類(lèi)禾草-內(nèi)生真菌共生體之一，其廣泛分布于我國(guó)西部和北部的大部天然草地。已知的侵染醉馬草的禾草內(nèi)生真菌主要有Epichlo? gansuensis和E. inebrins，這兩種禾草內(nèi)生真菌屬于E

2、pichlo?內(nèi)生真菌的無(wú)性態(tài)，其常通過(guò)宿主醉馬草的種子進(jìn)行垂直傳播，同時(shí)共生體種子也是一些種傳真菌進(jìn)行傳播的重要載體，其中包括部分引起種子苗期病害的重要病原真菌。前人報(bào)道稱(chēng)醉馬草-內(nèi)生真菌共生體對(duì)于退化草地物種豐富度的維持和恢復(fù)具有重要的生態(tài)意義，但是在醉馬草-內(nèi)生真菌共生體種子傳播和植株生長(zhǎng)過(guò)程中與種傳真菌及根際土壤微生物群落的相關(guān)性尚缺乏研究。對(duì)于禾草內(nèi)生真菌的分類(lèi)學(xué)、生理生化、生態(tài)學(xué)等的研究中發(fā)現(xiàn)其在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，

3、因此有必要基于其基因組采用其他方法對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的明確。本研究以帶菌(E+)和不帶菌(E-)醉馬草種子及其種傳真菌為研究對(duì)象，分別探討內(nèi)生真菌和種傳真菌之間的相關(guān)性、內(nèi)生真菌侵染對(duì)醉馬草根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及其機(jī)理，并結(jié)合Epichlo?模式菌Epichlo? festucae基因組對(duì)比分析醉馬草內(nèi)生真菌E.gansuensis基因組的進(jìn)化途徑，以期為醉馬草內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)利用及其生態(tài)意義的深入研究提供較為重要的科學(xué)依據(jù)。

4、研究得到的主要結(jié)果如下：
　　1.以E+和E-醉馬草種子為研究材料，對(duì)比種子表面消毒處理發(fā)現(xiàn)，表面消毒能顯著(P<0.05)降低醉馬草種子的霉變率并提高其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；相對(duì)于未攜帶內(nèi)生真菌的醉馬草種子，未消毒處理下，內(nèi)生真菌的侵染能顯著(P<0.05)降低醉馬草種子的霉變率并提高其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；干旱與消毒處理?xiàng)l件下，內(nèi)生真菌的侵染能明顯緩解干旱和種傳真菌給醉馬草種子的萌發(fā)帶來(lái)的抑制作用，低度(-0.3M

5、Pa)干旱脅迫條件下內(nèi)生真菌能顯著(P<0.05)降低醉馬草種子的霉變率并提高其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；滲透勢(shì)為-0.3MPa的PEG模擬干旱處理下，萌發(fā)期野大麥、麥賓草和中華羊茅種子的霉變率均顯著低于(P<0.05)對(duì)照處理且各萌發(fā)指標(biāo)明顯提高；貯藏期醉馬草種子的帶菌率和發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)隨著種子含水量的上升表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢(shì)，E+醉馬草種子萌發(fā)活力較強(qiáng)，這可能與內(nèi)生真菌誘導(dǎo)宿主醉馬草種子抗氧化酶系統(tǒng)快速反應(yīng)有關(guān)。<

6、br>　　2.以分離自6個(gè)不同種群的醉馬草(A. inebrians)、中華羊茅(Festuca sinensis)和野大麥(Hordeum brevisublatum)的12個(gè)(每種禾草選擇兩個(gè)種群，每個(gè)種群選擇一個(gè)菌株)內(nèi)生真菌菌株為研究材料，分析其與根腐離孺孢(Bipolaris sorokiniana)、燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)、細(xì)交鏈孢(Alternaria alternata)、德氏霉(Drechsl

7、era erythrospila)、新月彎孢(Curvularia lunata)5種病原真菌之間的互作關(guān)系，平板拮抗試驗(yàn)表明12個(gè)內(nèi)生真菌菌株相對(duì)于對(duì)照均能顯著(P<0.05)抑制5種病原真菌菌落的生長(zhǎng)，其中分離自醉馬草的2個(gè)菌株對(duì)所有病原真菌生長(zhǎng)的抑制作用較為明顯，不同地理種群內(nèi)生菌株之間的抑菌活性表現(xiàn)出一定的差異性；相對(duì)于對(duì)照，12株內(nèi)生真菌培養(yǎng)液均能顯著(P<0.05)抑制5種病原真菌菌株菌落的生長(zhǎng)，其中5種病原真菌菌落的生長(zhǎng)對(duì)

8、于分離自醉馬草的2個(gè)內(nèi)生真菌菌株較為敏感，不同地理種群內(nèi)生真菌菌株之間的抑菌活性具有一定的差異性；分析顯示內(nèi)生真菌對(duì)病原真菌的作用機(jī)理可能與其對(duì)病原真菌分生孢子較高的萌發(fā)抑制率具有一定的相關(guān)性。
　　3.以分離自醉馬草的內(nèi)生真菌菌株Eg(E. gansuensis)、分離自野大麥的內(nèi)生真菌菌株Eb(E. bromicola)和分離自麥賓草的內(nèi)生真菌菌株Et(Epichlo? sp.)為研究材料，探討其與分離自老芒麥(Elymus

9、sibiricus)的4種種傳病原真菌細(xì)交鏈孢(A. alternaria)、根腐離孺孢(B. sorokinianum)、燕麥鐮孢(F. avenaceum)和鐮刀菌(Fusarium sp.)之間互作對(duì)老芒麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示相對(duì)于空白對(duì)照，不同稀釋倍數(shù)內(nèi)生真菌培養(yǎng)液的浸種處理均能顯著(P<0.05)提高4種種傳真菌脅迫下老芒麥種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)，不同內(nèi)生真菌菌株之間作用結(jié)果具有一定的差異，并且同一菌株的不同稀釋

10、倍數(shù)之間也有較大的差異，不同菌株的最佳作用的稀釋倍數(shù)不同；分別選用Eb03、Et03和Eg02三個(gè)稀釋倍數(shù)的內(nèi)生真菌菌液進(jìn)行浸種預(yù)處理之后，在溫室栽培條件下觀測(cè)老芒麥的株高、分蘗和生物量發(fā)現(xiàn)均顯著(P<0.05)高于空白對(duì)照，其作用機(jī)理可能與不同內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的生物堿類(lèi)次生代謝產(chǎn)物濃度有關(guān)。
　　4.以E+、E-醉馬草植株及其根際土壤為研究材料，分析內(nèi)生真菌侵染對(duì)宿主醉馬草的生長(zhǎng)和根際土壤微生物的影響，結(jié)果顯示內(nèi)生真菌的侵染能顯

11、著(P<0.05)提高宿主醉馬草的株高、分蘗、地上生物量、地下生物量及根冠比；E+、E-醉馬草根際土壤中除土壤容重、碳氮比(C:N)比之間差異顯著(P<0.05)之外，其余各土壤物理和營(yíng)養(yǎng)狀況指標(biāo)均不顯著；基于高通量測(cè)序結(jié)果顯示，E+醉馬草根際土壤中真菌和細(xì)菌群落豐富度均明顯高于E-醉馬草根際土壤，內(nèi)生真菌的侵染提高了宿主醉馬草對(duì)根際土壤微生物多樣性的庇護(hù)；結(jié)合土壤因子和營(yíng)養(yǎng)差異分析顯示，醉馬草根際土壤中C:N的改變可能是引起真菌和細(xì)菌

12、群落變化的重要因素之一，同時(shí)盡管土壤pH值差異并不顯著(P>0.05)，但是它也是引起微生物多樣性差異的重要因素之一。
　　5.以醉馬草內(nèi)生真菌E. gansuensis基因組和E. festucae基因組為研究材料，基于兩個(gè)基因組密碼子的使用模式和偏好性分析其進(jìn)化因子，中性繪圖分析顯示中性進(jìn)化對(duì)這兩個(gè)基因組的影響較小，而自然選擇在其中扮演著主導(dǎo)作用，其對(duì)二者密碼子偏好性的影響分別達(dá)到了82.71％和95.14%；通過(guò)有效密碼字?jǐn)?shù)

13、(ENC)和第3位同義密碼子(GC3s)之間的相關(guān)性分析顯示，兩個(gè)基因組分別僅有2.08%和2.76%的基因表現(xiàn)出較高的密碼子偏好性，這就意味著供試內(nèi)生真菌基因組并沒(méi)有受到強(qiáng)烈的密碼子偏好性，其基因組密碼子的使用應(yīng)該是通過(guò)隨機(jī)選擇完成的；對(duì)密碼子使用的各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示，兩個(gè)內(nèi)生真菌基因組密碼子使用的偏好性除受有效密碼字?jǐn)?shù)的影響之外，同樣受到核苷酸的組成和基因的表達(dá)水平的影響；兩個(gè)內(nèi)生真菌基因組中分別鑒定出了26個(gè)和27個(gè)以G或C