血漿HDL中蛋白質(zhì)組分與冠心病的關(guān)系及應(yīng)用他汀類(lèi)藥后的變化研究.pdf

1、一、研究背景
　　 近年來(lái)已經(jīng)對(duì)高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)蛋白質(zhì)組分的含量及變化情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:冠心病（coronary heart disease，CHD）患者的HDL蛋白質(zhì)組成發(fā)生變化，聯(lián)合應(yīng)用他汀類(lèi)藥物+煙酸后，CHD患者的HDL蛋白質(zhì)組成趨向于“正常化”。不過(guò)，該領(lǐng)域的研究尚少，結(jié)果差異較大，驗(yàn)證性工作不足，有必要開(kāi)展進(jìn)一步的研究工作。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期

2、應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較了CHD患者與非CHD患者（對(duì)照組）之間的HDL蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CHD組HDL中的載脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）水平顯著下降，血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid Aprotein，SAA)水平顯著升高，但是尚缺乏較大樣本的驗(yàn)證性研究。目前國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道單獨(dú)應(yīng)用他汀類(lèi)藥物治療冠心病患者前后HDL蛋白質(zhì)組的變化，且研究已顯示他汀類(lèi)藥物可與HDL之間存在功能

3、的相互作用，機(jī)制并不十分清楚。因此，本研究擬從兩方面進(jìn)行研究:①，驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)室前期獲得的結(jié)果，探討HDL中SAA和apoA-I蛋白水平的變化及與冠心病的關(guān)系;②,采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較他汀類(lèi)藥物使用前后HDL組分的變化，以探討CHD患者在服用他汀類(lèi)藥物的調(diào)脂治療過(guò)程中HDL蛋白組分是否有變化，這種變化是否與患者的療效有關(guān)。同時(shí)也希望從另一角度即HDL組分的變化來(lái)探討他汀類(lèi)藥物的作用機(jī)制。
　　 二、研究?jī)?nèi)容：
　　 第

4、一部分冠心病患者血漿HDL中apoA-I與SAA組分變化的研究
　　 1.研究目的：
　　 比較CHD患者與非CHD患者（對(duì)照組）血漿HDL中apoA-I與SAA組分差異。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究對(duì)象:
　　 2.1.1 CHD組:至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50％，未服用調(diào)脂藥;
　　 2.1.2對(duì)照組:排除CHD，且年齡、性別與CHD組相匹配;
　　 2.2樣品收

5、集與HDL分離:收集空腹血漿，應(yīng)用溴化鉀超高速離心方法分離血漿中的HDL;
　　 2.3 ELISA法檢測(cè)血漿及其HDL中的apoA-I和SAA的水平;
　　 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:pearson相關(guān)性分析研究血漿及HDL中apoA-I和SAA的相關(guān)性;logistic回歸分析研究血漿及HDL中這兩種蛋白與CHD的關(guān)聯(lián)程度。
　　 3.研究結(jié)果：
　　 3.1 HDL中apoA-I和SAA水平變化
　　

6、 3.1.1 CHD組(n=67)與對(duì)照組(n=67)相比，HDL-apoA-I水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7.80±3.32g/mL vs.10.42±5.51 g/mL，P=0.001）;校正可能的混雜因素后，其在兩組間的顯著性差異消失(B=-0.109，P=0.088)。
　　 3.1.2 CHD組與對(duì)照組相比,log(HDL-SAA)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.39±0.58 vs.1.15±0.46，P=0.01

7、1）;校正可能的混雜因素后，其在兩組之間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(B=1.738，P=0.017)，且log(HDL-SAA)每升高一個(gè)單位，CHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高4.685倍(OR=5.685，95％CI:1.371，23.581)。
　　 3.2血漿中apoA-I和SAA水平變化
　　 3.2.1 CHD組(n=67)和對(duì)照組(n=67)相比，plasma-apoA-I的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.7±0.33 g/mL vs.

8、0.79±0.28g/mL， P=0.122)。
　　 3.2.2 CHD組和對(duì)照組相比，log(plasma-SAA)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.13±0.54 vs.0.88±0.48，P=0.005）;校正可能的混雜因素后，其在兩組之間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(B=1.646，P=0.038)，且log(plasma-SAA)每升高1個(gè)單位，CHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高4.185倍(OR=5.185，95％CI:1.095，24.

9、544)。
　　 3.3 pearson相關(guān)性分析:在對(duì)照組及CHD組的血漿及HDL中apoA-I與SAA的相關(guān)系數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.第一部分研究結(jié)論
　　 4.1與對(duì)照組相比，CHD患者HDL蛋白質(zhì)組成發(fā)生改變:SAA水平明顯升高，apoA-I有下降趨勢(shì)。
　　 4.2血漿中apoA-I在兩組之間無(wú)明顯差異;CHD組血漿SAA明顯升高。提示HDL及血漿中SAA均為CHD的危險(xiǎn)因素。
　　

10、 第二部分冠心病患者服用他汀類(lèi)藥物后血漿HDL蛋白質(zhì)組分變化的研究
　　 （一）冠心病患者服用他汀類(lèi)藥物前后血漿HDL蛋白質(zhì)組成變化的比較
　　 1.研究目的：
　　 探索CHD患者服用他汀類(lèi)藥物前后HDL蛋白質(zhì)的組成及各組分水平的差異。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究對(duì)象:
　　 2.1.1CHD組(n=9);至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50％，入組時(shí)未服用他汀等調(diào)脂藥，參加隨訪

11、;
　　 2.1.2對(duì)照組(n=10):排除CHD，且年齡、性別與CHD組相匹配;
　　 2.2樣品的收集與分離:收集CHD組服用他汀類(lèi)藥物半年前后（藥前組、藥后組）及對(duì)照組的空腹血漿;溴化鉀超高速離心法分離HDL樣品;
　　 2.3 iTRAQ-LC-MS技術(shù):研究藥前組、藥后組及對(duì)照組之間HDL蛋白質(zhì)組成及各組分水平的相對(duì)定量;
　　 2.4 Gene Ontology(GO)功能分析:利用GO功能分

12、析鑒定到的蛋白質(zhì)分子功能、參與的生物過(guò)程及細(xì)胞組成分布的特點(diǎn);
　　 2.5蛋白質(zhì)聚類(lèi)分析:三組之間HDL組分差異水平特點(diǎn)。
　　 3.研究結(jié)果：
　　 3.1在藥前組、藥后組和對(duì)照組的HDL鑒定出196種高置信度的蛋白質(zhì)組分。
　　 3.2 GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有多種分子活性，參與多種生物學(xué)過(guò)程。
　　 3.3聚類(lèi)分析顯示CHD患者服用他汀類(lèi)藥物前與對(duì)照組HDL蛋白水平之間的差異大于CHD患者

13、藥后與對(duì)照組HDL蛋白水平之間的差異。
　　 3.4 CHD患者藥前藥后比較發(fā)現(xiàn)14種差異蛋白;在CHD組與對(duì)照組之間發(fā)現(xiàn)13種差異蛋白;其中serum amyloid A2 isoform(SAA2)、complement C5 preproprotein和histone H1.0三種蛋白的變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為在CHD組顯著升高，服用他汀類(lèi)藥物后其在HDL中的含量顯著下降，下降水平接近對(duì)照組。
　　 4.研究小結(jié)：

14、　　 4.1在CHD藥前、藥后和對(duì)照組的HDL中共鑒定出196種高置信度的蛋白質(zhì)組分;
　　 4.2GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有多種分子活性，參與多種生物學(xué)過(guò)程;
　　 4.3聚類(lèi)分析顯示CHD患者服用他汀類(lèi)藥物前與對(duì)照組HDL蛋白水平之間的差異大于CHD患者藥后與對(duì)照組HDL蛋白水平之間的差異。
　　 4.4 CHD患者藥前藥后比較發(fā)現(xiàn)14種差異蛋白;在CHD組與對(duì)照組之間發(fā)現(xiàn)13種差異蛋白;其中serum am

15、yloid A2 isoform(SAA2)、complement C5 preproprotein和histone H1.0三種蛋白的變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為在CHD組顯著升高，服用他汀類(lèi)藥物后其在HDL中的含量顯著下降，下降水平接近對(duì)照組
　　 （二）冠心病患者服用他汀類(lèi)藥物前后血漿HDL中SAA差異水平的變化
　　 1.研究目的：
　　 比較CHD患者服用他汀類(lèi)藥物前后HDL中SAA的水平，初步驗(yàn)證iTRAQ-LC

16、-MS中發(fā)現(xiàn)的候選差異蛋白SAA2的水平。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究對(duì)象:
　　 2.1.1 CHD組(n=44);至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50％，入組時(shí)未服用他汀等調(diào)脂藥，參加隨訪;
　　 2.1.2對(duì)照組(n=45):排除CHD，且年齡、性別與CHD患者相匹配;
　　 2.2樣品的收集與分離:收集CHD組服用他汀類(lèi)藥物半年前后（藥前組、藥后組）及對(duì)照組的空腹血漿;溴化鉀超高速離

17、心法分離HDL樣品;
　　 2.3 ELISA法檢測(cè):CHD藥前組與藥后組HDL樣品中SAA水平。
　　 3.研究結(jié)果：
　　 與藥前HDL中l(wèi)og(HDLSAA)的水平相比，CHD患者服用他汀類(lèi)后HDL中的SAA水平明顯下降（1.28±0.51 vs.1.01±0.51，P=0.014），與iTRAQ結(jié)果一致。
　　 4.研究小結(jié)：
　　 他汀類(lèi)藥物可顯著下調(diào)HDL中SAA的水平。
　　

18、 （三）服用他汀類(lèi)藥物與未服用他汀類(lèi)藥物的冠心病患者血漿HDL中SAA差異水平的研究
　　 1.研究目的：
　　 比較服用他汀類(lèi)藥物半年的CHD患者與未服用他汀類(lèi)藥物的CHD患者血漿HDL中SAA的水平，再次驗(yàn)證iTRAQ-LC-MS中鑒定的候選差異蛋白SAA2水平。
　　 2.研究方法：
　　 2.1研究對(duì)象:
　　 2.1.1 CHD用藥組(n=65):至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50％，入組時(shí)

19、已經(jīng)規(guī)律服用他汀類(lèi)藥物半年左右，未合并使用其他調(diào)脂藥;
　　 2.1.2CHD未用藥組(n=67):至少有一支冠狀動(dòng)脈狹窄大于50％，未服用任何調(diào)脂藥;
　　 2.2樣品收集與HDL分離:收集空腹血漿;超高速離心分離HDL樣品;
　　 2.3 ELISA法檢測(cè):CHD用藥組與CHD未用藥組HDL樣品中SAA水平;
　　 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:利用協(xié)方差分析的方法校正兩組之間的基線差異。
　　 3.研究

20、結(jié)果：
　　 3.1CHD用藥組HDL中的log(HDL-SAA)水平與CHD未用藥組相比，顯著下降(1.34±0.58 vs.1.04±0.46, P=0.0002)。
　　 3.2校正總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、apoA-I、載脂蛋白B、肌酐、血糖及高敏C反應(yīng)蛋白的水平差異后，log(HDL-SAA)在兩組之間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。
　　 3.3進(jìn)一步校正HDL-C的水平，log(HDL-

21、SAA)在兩組之間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。
　　 4.研究小結(jié)：
　　 HDL中的SAA水平與CHD患者服用他汀類(lèi)藥物有關(guān)。
　　 三、結(jié)論：
　　 1.CHD患者HDL蛋白質(zhì)組成發(fā)生改變:其中SAA水平明顯升高，apoA-I有下降趨勢(shì)。SAA為CHD的危險(xiǎn)因素。iTRAQ技術(shù)又新發(fā)現(xiàn)CHD組與對(duì)照組之間有13種差異蛋白（6種在CHD組HDL中上調(diào)，7種下調(diào)）。
　　 2.CHD患