三類新型集成化的基因芯片及其相關(guān)儀器的研制.pdf

1、基因芯片技術(shù)是一種高通量的現(xiàn)代生物檢測(cè)技術(shù)，在功能基因研究、新藥篩選、疾病的基因診斷等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。基因芯片檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括：靶基因的擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記、芯片雜交與清洗、雜交信號(hào)檢測(cè)及分析等。在這樣的一個(gè)復(fù)雜檢測(cè)流程中，容易產(chǎn)生由于操作過程的復(fù)雜性而帶來的檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，從而影響了基因芯片的推廣應(yīng)川。我們研制基因擴(kuò)增雜交一體化檢測(cè)儀的目的是為了實(shí)現(xiàn)從基因擴(kuò)增、熒光標(biāo)記、雜交與清洗、芯片信號(hào)檢洲的一系列流程的自動(dòng)化操作，

2、以減少檢測(cè)結(jié)果的人為兇素的干擾，提高基因芯片在基因多態(tài)性分析及疾病診斷等方面的應(yīng)用水平。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化基因擴(kuò)增雜交榆測(cè)一體化芯片結(jié)構(gòu)及其儀器的復(fù)雜性，我們義提出了管蓋基兇芯片。為能夠?qū)Χ鄠€(gè)靶基因?qū)崿F(xiàn)定量檢測(cè)，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室提出的TaqMan微陣列芯片的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)和研制了定量基兇芯片檢測(cè)系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)了一種新的FRET定量柃測(cè)基因芯片，可用于同一樣品中不同基因的高通量定量檢測(cè)。 基因擴(kuò)增雜交一體化芯片及檢測(cè)系統(tǒng)針對(duì)基因芯片檢測(cè)過程

3、的復(fù)雜性，我們?cè)O(shè)計(jì)了集成化的操作平臺(tái)-基因擴(kuò)增雜交檢測(cè)一體化芯片，用于實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增、雜交、清洗、檢測(cè)的自動(dòng)化以減少?gòu)?fù)雜操作過程中的人為因素影響?；驍U(kuò)增雜交檢測(cè)一體化芯片的結(jié)構(gòu)包括二個(gè)功能區(qū)域：十四個(gè)通道的玻璃毛細(xì)管作為基因擴(kuò)增區(qū)域和由十四個(gè)在玻片上同定了核酸探針陣列的基因芯片組成的雜交檢測(cè)區(qū)。使用了硅膠作為密封件，分別將二個(gè)區(qū)域相連。該芯片可實(shí)現(xiàn)十四個(gè)通道的基因擴(kuò)增與基因芯片檢測(cè)一體化，檢測(cè)樣品流程所需要的時(shí)間為3～4小時(shí)。

4、基于上述牛物芯片，我們?cè)O(shè)計(jì)和研制了基因擴(kuò)增雜交一體化檢測(cè)儀，能夠進(jìn)行PCR、生物芯片雜交和熒光榆測(cè)的。體化操作?；驍U(kuò)增雜交一體化檢測(cè)儀主要由溫度精確控制系統(tǒng)、樣品自動(dòng)注入系統(tǒng)和熒光榆測(cè)幾部分組成，包括：計(jì)算機(jī)、加熱爐、熒光顯微鏡、溫度控制器、試樣裝夾及送進(jìn)機(jī)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)控制箱、清洗機(jī)構(gòu)等。與南京依科機(jī)電有限公司合作開發(fā)出相應(yīng)的產(chǎn)品，通過了江蘇省醫(yī)療器械檢測(cè)所的檢驗(yàn)，建立了醫(yī)療器械注冊(cè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。該儀器有如下的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 雜交過程的溫

5、度控制通過空氣介導(dǎo)的溫控體系來實(shí)現(xiàn)。具有變溫快、溫度場(chǎng)均勻等優(yōu)點(diǎn)。此儀器能夠?qū)CR反應(yīng)區(qū)的溫度進(jìn)行精確控制，其溫度上升的速率可達(dá)劍20℃/s，下降的速率可達(dá)到10℃/s。 芯片的熒光雜交信號(hào)檢測(cè)是通過熒光顯微鏡與CCD的圖像采集技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。芯片被固定存維移動(dòng)平臺(tái)上在顯微鏡下進(jìn)行熒光信號(hào)的掃描閱讀，在PC機(jī)上顯示，存入計(jì)算機(jī)?；∩鲜鲂酒蛢x器，我們發(fā)展了用于乙型肝炎基因突變檢測(cè)的試劑，可以對(duì)乙型肝炎YMD突變基因進(jìn)行檢測(cè)，并在

6、南京市第二醫(yī)院進(jìn)行了臨床檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)劍100﹪。通過與在普通玻片瓊脂糖基膜上固定了用于檢測(cè)YMDD突變的分子信標(biāo)探針芯片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，得到了相似的雜交檢測(cè)信號(hào)。結(jié)果表明，這種新型的生物芯片可以滿足臨床檢測(cè)的需求。管蓋基因芯片及檢測(cè)系統(tǒng)為進(jìn)一步簡(jiǎn)化上述基因擴(kuò)增雜交檢測(cè)一體化芯片的復(fù)雜性，我們提出了直接在Eppendorf管內(nèi)完成基因芯片的基因擴(kuò)增雜交檢測(cè)的新方案一管蓋基因芯片技術(shù)。管蓋基因芯片是一個(gè)基因擴(kuò)增到雜交檢測(cè)的全封閉器

7、件，基因探針同定存特制的基因擴(kuò)增管的管蓋內(nèi)表面，并在這個(gè)封閉的體系中加入了一個(gè)雜交液貯液池。研究結(jié)果表明，管蓋基因芯片能夠成功地在一個(gè)仝封閉且無(wú)清洗的基因芯片體系內(nèi)實(shí)現(xiàn)多重基因擴(kuò)增、芯片雜交及雜交信號(hào)的熒光檢測(cè)過程，而且能夠有效地避免了不同樣品間摹兇擴(kuò)增產(chǎn)物的無(wú)交叉污染。 我們?cè)O(shè)計(jì)和研制了相應(yīng)的管蓋因芯片檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)系統(tǒng)包括熒光顯微鏡與CCD等硬件，以及相關(guān)圖像分析和數(shù)據(jù)處理軟件。該軟件可對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行圖像捕獲、貯存并進(jìn)行圖像

8、分析、雜交強(qiáng)度計(jì)算、檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化與數(shù)字化。 在管蓋基因芯片研究的基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)和研制了可同時(shí)檢測(cè)SARS、副流感I、腸病毒、風(fēng)疹、副流感Ⅲ、流感B、麻疹、RSV、鼻病毒、流感 A 等 10 種病毒的管蓋基因芯片，用于檢測(cè)引起流感類似癥狀的主要病原體，以期對(duì)于SARA-CoV感染與流感等具有相似的早期臨床癥狀的病人進(jìn)行早期的鑒別。研制出可進(jìn)行臨床使用的檢測(cè)試劑盒。在上述九種病原體的檢測(cè)管蓋基因芯片的基礎(chǔ)上，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性最穩(wěn)

9、定的五種病毒檢測(cè)探針(SARS、副流感I、腸病毒、風(fēng)疹、流感A)制備檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品，其中一種風(fēng)疹病毒探針的作為內(nèi)控陽(yáng)性指標(biāo)，用以監(jiān)測(cè)檢測(cè)過程的有效性，減少假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。制定了檢測(cè)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、生產(chǎn)檢定標(biāo)準(zhǔn)、試劑使用說明書。該產(chǎn)品通過了國(guó)家生物制品檢定所的檢定。 我們開展了用于單堿基錯(cuò)配檢測(cè)的管蓋基因芯片的研究。以HlV-1病毒的耐藥基因突變作為檢測(cè)對(duì)象，我們?cè)诠苌w基因芯片的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一用于檢測(cè)基因突變的管蓋基因芯片。實(shí)

10、現(xiàn)了HIV-1病毒的抗藥性相關(guān)位點(diǎn)K65R．K103N，V106A．V1081，Y181C．Y184M和Y188C的單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)。 定量基因芯片掃描系統(tǒng)及FRET定量檢測(cè)基因芯片基因芯片是一種高通量的基因檢測(cè)技術(shù)，而定量PCR是一種基因定量檢測(cè)技術(shù)，兩者的有機(jī)結(jié)合將可進(jìn)行多基因的定量研究與應(yīng)用。最近，我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了一種基于同定Taqman探針技術(shù)的定量基因芯片。在此基礎(chǔ)上，本論文設(shè)計(jì)和研制了定量基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，提出了一種

11、多基因同時(shí)定量檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)，可用于同一樣品中不同基因的高通量定量檢測(cè)。我們研制的基于基因芯片的實(shí)時(shí)定量基因芯片掃描儀，包括硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)。硬件系統(tǒng)有光學(xué)系統(tǒng)、基因芯片掃描平臺(tái)和信號(hào)采集、信號(hào)傳遞系統(tǒng)溫控平臺(tái)等5個(gè)部分組成。軟件系統(tǒng)分為溫度控制、圖像定位、掃描控制、光源控制、信號(hào)處理、圖像處理、結(jié)果計(jì)算7個(gè)子系統(tǒng)。該系統(tǒng)基本達(dá)到了基因芯片適時(shí)定量檢測(cè)的要求。為了驗(yàn)證定量基因芯片掃描系統(tǒng)，對(duì)固定FRET探針的FRET定量檢測(cè)基因芯片進(jìn)