重要病原菌檢測基因芯片的研制.pdf

1、目的:致病菌引起的感染性疾病是近些年威脅人類健康和造成社會恐慌的主要因素，同時也是造成人類死亡的重要原因。而且，細菌性生物武器正日益受到恐怖組織的普遍重視，多起生物恐怖事件表明生物恐怖襲擊已成為現(xiàn)實的威脅，這些傳染病的暴發(fā)和流行構(gòu)成了嚴重公共衛(wèi)生，社會和經(jīng)濟問題?？焖?、靈敏、準確、特異地檢測致病菌是有效預(yù)防感染性疾病發(fā)生和控制其迅速傳播的前提和關(guān)鍵。本文的研究目的是建立針對多種常見腸道致病菌、重要烈性致病菌和潛在細菌性生物戰(zhàn)劑的快速、準

2、確、靈敏、高通量的基因芯片檢測技術(shù)平臺，為臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)督、傳染病防控及防生反恐等提供快速、有效的診斷手段。 方法:以16S rDNA和23S rDNA基因作為檢測靶片段，選取十五種常見腸道致病菌作為基因芯片檢測的靶細菌，設(shè)計和篩選通用性引物和特異性探針，優(yōu)化兩重PCR反應(yīng)體系，并探討核酸提取方法、引物不對稱比例、鎂離子濃度、退火溫度、退火時間、雜交溫度、雜交液成分等因素對基因芯片雜交的影響。以九種重要烈性致病菌的特異性基

3、因作為靶序列，設(shè)計并篩選引物和特異性探針，優(yōu)化六組兩重PCR體系，并探討引物不對稱比例、鎂離子濃度、dNTPs用量、DNA聚合酶用量、雜交溫度、雜交液成分等因素對基因芯片雜交的影響；優(yōu)化酪胺信號放大體系的反應(yīng)條件，并將酪胺信號放大體系與末端標(biāo)記法的靈敏度進行比較。在此綦礎(chǔ)上，確定兩種基因芯片體系的cutoff值，評價兩種方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性等性能指標(biāo)。 結(jié)果:1．十五利腸道致病菌基因芯片檢測方法的建立：本實驗選取的靶致病

4、菌為單核增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157：H7、耶爾森氏菌和霍亂弧菌。確定了最合適的基因組DNA提取方法為直接煮沸法，成功構(gòu)建了肉毒梭菌模板。最佳PCR擴增條件為：兩對引物的熒光引物與非熒光引物的比例均為1：10，終濃度為16S-F1，0.05 μmol/L、23S-F3，0.15 μmo

5、l/L；16S-R1，0.5 μmol/L、23S-R4，1.5μmol/L，Mg<'2+>濃度為2.0mmol/L，退火溫度為56℃，退火時間30s。最佳雜交條件為：雜交溫度為50℃，雜交液成分為5×SSC、0.2％SDS、2.5％甲酰胺。86種致病菌參考菌株均得到正確結(jié)果。確定了每種致病菌對應(yīng)探針的cutoff值。對單一致病菌檢測的靈敏度為10<'3>CFU/mL；對六種致病菌同時檢測的靈敏度為10<'5>CFU/mL。批間批內(nèi)變異

6、系數(shù)CV值均小于15％。對99例臨床樣本進行檢測，與常規(guī)培養(yǎng)法相比，正確率達到80.8％，其中包括4例混合致病菌感染。 2．九種重要烈性致病菌基因芯片檢測方法的建立：本實驗選取的靶致病菌及特異性基因為炭疽芽孢桿菌(pag)、鼠疫耶爾森氏菌(3a)、土拉桿菌(fopA)、布魯氏桿菌(BCSP)、傷寒沙門氏菌(vipR)、大腸桿菌0157：H7(rfbE、fliC)、痢疾桿菌(ipaH)、霍亂弧菌(ctxA、LPSgt)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏

7、菌(ail)，LPSgt基因能夠準確地區(qū)分霍亂弧菌O139和非O139； rfbE基因和fliC基因能夠有效甄別O157與H7血清型，16S rDNA基因作為內(nèi)對照。確定了3a和fliC、vipR和BCSP、pag和fopA、rfbE和16S、ctxA和ipaH、LPSgt和ail等六組兩重PCR反應(yīng)體系，建立了磁珠法富集和濃縮PCR產(chǎn)物。最佳雜交條件為：雜交溫度為50℃，雜交液成分為5×SSC、0.2％SDS、2.5％甲酰胺。顯色條件

8、為：鏈酶親和素HRP為1：1500稀釋；TSA-Cy3為1：1000稀釋，均在37℃下孵育30分鐘。28種致病菌標(biāo)準菌株均得到正確的檢測結(jié)果。確定了每種致病菌對應(yīng)探針的cutoff值。檢測鼠疫桿菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌O139、土拉桿菌、布魯氏菌的靈敏度均為10<'3>CFU/mL，比末端標(biāo)記法靈敏度提高10倍。模擬污染樣本的靈敏度為10<'4>CFU/mL/0.1g。批間批內(nèi)變異系數(shù)CV值均小于15％。對10例臨床樣本和20例雙盲模擬樣

9、本進行檢測，結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)法或雙盲結(jié)果一致。 結(jié)論:本研究建立的十五種腸道致病菌基因芯片檢測方法具有快速、準確、高通量等特點，重復(fù)性、特異性良好、靈敏度高，可作為食品安全檢測、細菌分類學(xué)研究和臨床診斷的初篩輔助工具。結(jié)合酪胺信號放大技術(shù)建立基因芯片檢測方法能夠快速、準確、特異、靈敏地鑒定九種重要烈性病原菌，并能對不同血清型進行甄別，該方法可為臨床診斷、衛(wèi)生監(jiān)督、食品安全檢測、傳染病防控及防生反恐等提供快速、有效的診斷手段，對控制