水牛體外受精胚胎性別鑒定研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)依靠其靈敏、快速和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為早期胚胎性別鑒定的主流技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可以充分發(fā)揮公母畜各自的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，提高育種效率。我國(guó)南方各省的水牛乳業(yè)資源豐富，發(fā)展?jié)摿薮螅_(kāi)展水牛早期胚胎性別鑒定研究工作的意義重大。但在性別鑒定的具體操作過(guò)程中，還存在著由于單一擴(kuò)增雄性特有的性別決定基因(Sry)失敗判定為陰性，雙引物雙重PCR擴(kuò)增時(shí)由于Sry基因單拷貝而常染色體基因多重復(fù)導(dǎo)致Sry

2、基因擴(kuò)增不充分或未能擴(kuò)增等問(wèn)題。本研究采用雙引物兩步PCR對(duì)水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，彌補(bǔ)單對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時(shí)Sry基因不易擴(kuò)增的不足，進(jìn)一步提高性別鑒定的精確度，優(yōu)化性別鑒定體系。應(yīng)用該優(yōu)化的性別鑒定體系對(duì)水牛早期16細(xì)胞胚胎性別鑒定的最適胚胎模板量進(jìn)行了探討，并對(duì)胚胎培養(yǎng)液中添加不同血清對(duì)水牛早期胚胎不同發(fā)育階段性別比率的影響進(jìn)行了初步研究。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.雙引物兩步PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞

3、性別研究：對(duì)引物設(shè)計(jì)的合理性和雙引物兩步PCR對(duì)性別鑒定的效果進(jìn)行探討，以期解決單對(duì)Sry基因引物擴(kuò)增時(shí)易出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時(shí)Sry基因不易擴(kuò)增的問(wèn)題，優(yōu)化性別鑒定體系。 (1)引物設(shè)計(jì)及其合理性檢測(cè)：根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的公水牛特有的Y染色體性別決定基因(Sry)序列和公、母水牛共有的常染色體1.715衛(wèi)星DNA序列，應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件自主設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物S1/S2、B1/B2。S1/S2引

4、物用于Sry基因體外擴(kuò)增，B1/B2引物用于1.715衛(wèi)星DNA序列體外擴(kuò)增。應(yīng)用所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物分別對(duì)公母水牛血液白細(xì)胞基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增，結(jié)果顯示，第一對(duì)引物S1/S2能夠有效的對(duì)公水牛血液白細(xì)胞基因組Sry基因進(jìn)行擴(kuò)增，而對(duì)母水牛血液白細(xì)胞基因組則無(wú)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為350bp，與所設(shè)計(jì)引物的理論擴(kuò)增值相符。第二對(duì)引物B1/B2在對(duì)公母水牛血液白細(xì)胞基因組1.715衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)，均有長(zhǎng)度為149bp擴(kuò)增

5、產(chǎn)物出現(xiàn)，也與所設(shè)計(jì)引物的理論擴(kuò)增值相符。 試驗(yàn)結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物能夠有效的對(duì)公水牛特有的Sry基因和公母水牛共有的1.715衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行體外擴(kuò)增，可應(yīng)用于性別鑒定體系。 (2)雙引物雙重PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞性別研究：為了杜絕單一Sry基因擴(kuò)增失敗或胚胎丟失導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象，本試驗(yàn)應(yīng)用雙引物雙重PCR對(duì)公水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定。同時(shí)擴(kuò)增出兩條特異擴(kuò)增帶的判定為雄性。結(jié)果顯示，全部10份血樣均成功擴(kuò)增

6、出1.715衛(wèi)星DNA序列(149bp)，但只有3份血樣擴(kuò)增出Sry基因(350bp)，準(zhǔn)確率為30.00﹪(3/10)。 試驗(yàn)結(jié)果表明：雙引物雙重PCR雖然可以避免單一Sry基因擴(kuò)增失敗或胚胎丟失導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象，提高性別鑒定的準(zhǔn)確性，但由于Sry基因?yàn)閱慰截悾?.715衛(wèi)星DNA序列為多重復(fù)序列，在進(jìn)行同步擴(kuò)增時(shí)，由于后者的模板量大，反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，因此會(huì)導(dǎo)致Sry基因擴(kuò)增不充分或完全擴(kuò)增不出特異擴(kuò)增帶。 (3)雙

7、引物兩步PCR鑒定水牛血液白細(xì)胞性別研究：針對(duì)雙引物雙重PCR進(jìn)行性別鑒定時(shí)單拷貝Sry基因在反應(yīng)中的競(jìng)爭(zhēng)力差的問(wèn)題，本試驗(yàn)首先采用雙引物兩步PCR進(jìn)行公水牛血液白細(xì)胞性別鑒定。先加入第一對(duì)引物對(duì)單拷貝的SRY基因進(jìn)行11個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，使得隨后的雙重?cái)U(kuò)增時(shí)兩種基因序列的模板量趨于一致，再加入第二對(duì)引物進(jìn)行雙重同步擴(kuò)增。結(jié)果顯示，5份公牛血樣均成功擴(kuò)增出的兩條特異擴(kuò)增帶(350bp，149bp)。性別鑒定準(zhǔn)確率為100﹪(5/5)。隨后分別

8、對(duì)兩份公牛血樣和兩份母牛血樣進(jìn)行性別鑒定，結(jié)果顯示，2份公水牛血樣均可擴(kuò)增出兩條特異擴(kuò)增帶(350bp，149bp)，而兩份母水牛血樣只擴(kuò)增出一條擴(kuò)增帶(149bp)。性別鑒定準(zhǔn)確率為100﹪(4/4)。 試驗(yàn)結(jié)果表明：兩步PCR能夠成功對(duì)水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，準(zhǔn)確率為100﹪。并能夠克服單對(duì)Sry基因引物擴(kuò)增時(shí)易出現(xiàn)假陰性、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時(shí)Sry基因不易擴(kuò)增的缺點(diǎn)。以下試驗(yàn)中均采用兩步PCR進(jìn)行水牛早期胚胎性別鑒定

9、。 2.水牛早期胚胎性別鑒定最適胚胎模板量研究：應(yīng)用前面試驗(yàn)優(yōu)化的性別鑒定體系分別以4個(gè)和2個(gè)胚胎卵裂球?yàn)槟０鍖?duì)水牛16細(xì)胞胚胎進(jìn)行了性別鑒定。結(jié)果顯示，以4個(gè)卵裂球作為模板時(shí)，23枚體外受精胚胎性別鑒定中雄性胚胎較多(13/23，56.52﹪)，雄性和雌性胚胎的比率接近1∶1。以2個(gè)卵裂球作為模板時(shí)，雌雄胚胎比例偏離1∶1的比值較遠(yuǎn)，雌性胚胎明顯偏多(19/26，73.08﹪)。 試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)水牛早期體外受精胚胎進(jìn)

10、行性別鑒定時(shí)，應(yīng)使用至少4個(gè)卵裂球作為PCR反應(yīng)的模板，以保證性別鑒定的準(zhǔn)確率。利用水牛血液基因組建立的性別鑒定體系能夠成功的對(duì)水牛體外受精胚胎進(jìn)行性別鑒定。 3.胚胎培養(yǎng)液中添加不同血清對(duì)水牛早期胚胎不同發(fā)育階段性別比率的影響：本試驗(yàn)應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的水牛早期體外受精胚胎性別鑒定體系，比較了在胚胎培養(yǎng)液中添加胎牛血清(FCS)、發(fā)情牛血清(OCS)和不添加血清對(duì)水牛體外受精胚胎發(fā)育能力及同一時(shí)間處于不同發(fā)育階段胚胎的性別比率的

11、影響。 試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第四天收集到的各組胚胎中，不添加血清組胚胎只能發(fā)育到8細(xì)胞期，而添加發(fā)情牛血清和胎牛血清的處理組胚胎均可發(fā)育到16細(xì)胞期，且添加胎牛血清組的胚胎發(fā)育潛力優(yōu)于發(fā)情牛血清組。但兩組之間的16細(xì)胞期胚胎發(fā)育率(18/62，29.03﹪Vs13/59,22.03﹪)差異不顯著(P＞0.05)。各血清組中處于同一時(shí)間不同發(fā)育階段的胚胎性別比例的差異不顯著(P＞0.05)，雄性胚胎比率均接近50﹪。胎牛血清組從4

12、細(xì)胞期到8細(xì)胞期的發(fā)育過(guò)程中雄性胚胎比率有逐漸上升的趨勢(shì)。而不添加血清組和添加發(fā)情牛血清組的不同階段雄性胚胎率未表現(xiàn)出隨著胚胎的不斷發(fā)育，雄性胚胎比率逐漸增多的現(xiàn)象。 試驗(yàn)結(jié)果表明：添加發(fā)情牛血清可以在一定程度上促進(jìn)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，穩(wěn)定胚胎的性別比率?？捎冒l(fā)情牛血清代替胎牛血清用于胚胎體外生產(chǎn)。 綜上所述：本研究中所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物特異性較強(qiáng)，采用雙引物兩步PCR對(duì)水牛血液白細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定，彌補(bǔ)單對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)假陰性、

13、雙引物雙重PCR擴(kuò)增時(shí)Sry基因不易擴(kuò)增的不足，進(jìn)一步提高性別鑒定的精確度，優(yōu)化性別鑒定體系。利用優(yōu)化了的性別鑒定體系能夠成功對(duì)水牛早期體外受精胚胎進(jìn)行性別鑒定。在性別鑒定過(guò)程中應(yīng)以至少4個(gè)卵裂球作為PCR反應(yīng)模板。應(yīng)用建立的性別鑒定體系對(duì)同一時(shí)間位于不同發(fā)育階段(阻滯期前后的4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞)水牛ⅣF早期胚胎進(jìn)行性別鑒定發(fā)現(xiàn)添加發(fā)情牛血清可以在一定程度上促進(jìn)胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育，并且穩(wěn)定胚胎的性別比率，從而進(jìn)一步減少影響體外生產(chǎn)胚胎