厲眼蕈蚊傳播核盤(pán)菌弱致病性相關(guān)DNA病毒1研究.pdf

1、真菌病毒(Mycovirus或Fungal virus)是指侵染真菌并在寄主真菌細(xì)胞中復(fù)制的病毒。部分真菌病毒侵染植物病原真菌后導(dǎo)致寄主致病力減弱，這類(lèi)病毒是潛在的植物真菌病害生物防治資源。前人研究表明真菌病毒依賴(lài)寄主的有性和/或者無(wú)性孢子進(jìn)行垂直傳播，或者通過(guò)寄主菌絲體融合進(jìn)行水平傳播。目前并沒(méi)有關(guān)于真菌病毒傳播介體的報(bào)道。
　　厲眼蕈蚊（Lycoriella ingenua）是一種常見(jiàn)的噬真菌昆蟲(chóng)，其成蟲(chóng)體型細(xì)小(1.8-3.

2、2 mm)，常鉆入培養(yǎng)皿中產(chǎn)卵于真菌菌落上，卵孵化后幼蟲(chóng)取食真菌菌絲。厲眼蕈蚊食譜廣泛，也可以取食核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在培養(yǎng)核盤(pán)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)感染了核盤(pán)菌弱致病性相關(guān)DNA病毒1（Sclerotinia sclerotiorumhypovirulence-associated DNA virus1，SsHADV-1）的核盤(pán)菌菌株比未感染病毒的菌株對(duì)厲眼蕈蚊具有更強(qiáng)的吸引力。推定厲眼草蚊與SsHADV-1

3、之間存在特定的互作關(guān)系。為了驗(yàn)證厲眼蕈蚊與SsHADV-1之間是否存在相互作用，采用感染SsHADV-1的核盤(pán)菌菌株DT-8飼養(yǎng)厲眼蕈蚊，然后檢測(cè)厲眼蕈蚊是否能夠從菌株DT-8獲得SsHADV-1并將病毒傳播給不攜帶病毒的核盤(pán)菌菌株、研究厲眼蕈蚊與SsHADV-1之間可能存在的互作關(guān)系。本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　挑取飼養(yǎng)于菌株DT-8菌落上的厲眼蕈蚊幼蟲(chóng)用無(wú)菌ddH2O清洗3遍后提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以檢測(cè)到病毒的DN

4、A，表明幼蟲(chóng)體內(nèi)或體表攜帶了SsHADV-1。幼蟲(chóng)取食菌株DT-8后即使饑餓處理7天，仍然可以檢測(cè)到病毒。之后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在厲眼蕈蚊的蛹、成蟲(chóng)和卵中也可以通過(guò)PCR擴(kuò)增和Southern blot雜交兩種方法檢測(cè)到SsHADV-1的DNA。采用免疫熒光觀察證明病毒存在于厲眼蕈蚊幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)的中腸和輸卵管及卵等部位。幼蟲(chóng)取食攜帶SsHADV-1的核盤(pán)菌時(shí)，僅取食0.5 hr就可以快速獲得病毒。將菌株DT-8菌落上飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)及病毒粒子

5、注射的幼蟲(chóng)飼養(yǎng)于SsHADV-1的非寄主灰葡萄孢B05.10菌落上，經(jīng)化蛹、羽化、交配、產(chǎn)卵并孵化后，后代幼蟲(chóng)也可以檢測(cè)到病毒存在，且檢出率到達(dá)80％以上，表明該病毒可以經(jīng)卵傳播。
　　采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SsHADV-1的Rep和CP在厲眼草蚊體內(nèi)表達(dá)，推定SsHADV-1可能可以在昆蟲(chóng)體內(nèi)復(fù)制。為了證明該病毒是否可以在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，用純化的SsHADV-1病毒粒子接種草地螟夜蛾細(xì)胞系(Spodopterafrugiper

6、da cells)Sf9細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增和Northern blot雜交可以檢測(cè)到SsHADV-1的Rep和CP在病毒接種的Sf9細(xì)胞中表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)也可以在Sf9細(xì)胞中觀察到SsHADV-1的熒光信號(hào)。qPCR檢測(cè)顯示病毒基因組DNA在Sf9細(xì)胞中可以大量地復(fù)制積累。對(duì)初始濃度為300 ng/μl的病毒粒子懸液進(jìn)行梯度稀釋后接種Sf9細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)稀釋1000倍后仍然可以感染Sf9細(xì)胞;采用流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)現(xiàn)SsHADV-1

7、(30ng/μl)接種Sf9細(xì)胞24 hr后細(xì)胞感染率可以達(dá)到60％左右。繼代培養(yǎng)病毒侵染的Sf9細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)病毒可以從侵染的Sf9細(xì)胞中釋放出來(lái)感染新的Sf9細(xì)胞。感染病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液也可以直接侵染不攜帶病毒的核盤(pán)菌，并導(dǎo)致核盤(pán)菌出現(xiàn)類(lèi)似菌株DT-8的特性。
　　為了明確攜帶病毒的厲眼蕈蚊是否可以將病毒傳播給不攜帶病毒的核盤(pán)菌菌株，將菌株DT-8菌落上飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)用無(wú)菌水沖洗3次后移至菌株DT-8VF（不攜帶病毒）的菌落上

8、繼續(xù)取食，從幼蟲(chóng)取食的蟲(chóng)道上挑取菌絲塊移至新的PDA平板上培養(yǎng)，獲得繼代培養(yǎng)菌株，采用PCR擴(kuò)增逐個(gè)檢測(cè)39個(gè)菌絲塊形成的菌落，檢出率達(dá)到20.5％，滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增-Southern blot雜交進(jìn)一步證實(shí)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的菌株攜帶SsHADV-1。獲得病毒的菌株表現(xiàn)出顯著的致病力衰退及其它相關(guān)表型，但其衰退程度不及菌株DT-8，病毒DNA的含量也較低，不能直接通過(guò)電泳檢測(cè)到。幼蟲(chóng)在菌株DT-8VF菌落上取食0.5 hr即可成功傳播病毒。進(jìn)

9、一步研究發(fā)現(xiàn)攜帶SsHADV-1的厲眼蕈蚊卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)均可以傳播該病毒。室內(nèi)模擬油菜田傳毒試驗(yàn)顯示厲眼蕈蚊成蟲(chóng)在發(fā)病的油菜上也可以傳播SsHADV-1。為了排除厲眼蕈蚊攜帶感染病毒的菌絲碎片而傳播病毒的可能性，用SsHADV-1病毒粒子懸液注射幼蟲(chóng)饑餓處理1天后取食不攜帶病毒的核盤(pán)菌，發(fā)現(xiàn)也可以將病毒傳播給菌株DT-8VF。病毒粒子注射的蛹經(jīng)羽化、交配和產(chǎn)卵后，將卵塊轉(zhuǎn)移至核盤(pán)菌菌落中，孵化出的幼蟲(chóng)取食核盤(pán)菌，也可以將病毒傳染給菌

10、株DT-8VF。
　　厲眼蕈蚊成蟲(chóng)趨向于攜帶SsHADV-1的核盤(pán)菌菌株產(chǎn)卵，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將活性炭放置在攜帶病毒菌株與不攜帶病毒菌株的菌落之間可以干擾厲眼蕈蚊成蟲(chóng)的選擇趨向性。收集兩種菌落釋放的揮發(fā)性氣體進(jìn)行“Y”形管行為測(cè)定，發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)對(duì)菌株DT-8釋放的氣體具有強(qiáng)烈的趨化行為，表明病毒可能促進(jìn)或抑制了特定的揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生。收集這兩個(gè)核盤(pán)菌菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，進(jìn)行GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)菌株DT-8和DT-8VF所釋放的氣體在組

11、份上沒(méi)有顯著差異，但是菌株DT-8所釋放的蘑菇醇和辛酮明顯少于菌株DT-8VF。“Y”形管行為測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明蘑菇醇和辛酮對(duì)厲眼草蚊雌成蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的趨避作用。表明SsHADV-1侵染核盤(pán)菌后可以減少蘑菇醇和辛酮的產(chǎn)生，從而吸引厲眼蕈蚊成蟲(chóng)趨向于攜帶病毒的核盤(pán)菌菌株產(chǎn)卵。qRT-PCR測(cè)定也表明在菌株DT-8中合成蘑菇醇和辛酮相關(guān)的部分基因表達(dá)量顯著降低。同時(shí)感染病毒的厲眼蕈蚊雌成蟲(chóng)懷卵量顯著提高28.9％，表明SsHADV-1與厲眼蕈蚊

12、之間可能存在互惠性的相互作用。
　　調(diào)查華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地及湖北省咸寧市和鄂州市的油菜田，發(fā)現(xiàn)厲眼蕈蚊可以在自然發(fā)病的油菜田中生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，幼蟲(chóng)偏向于在發(fā)病的油菜莖稈內(nèi)部取食核盤(pán)菌菌絲并在其中化蛹，成蟲(chóng)在油菜葉片和花瓣上活動(dòng)。在噴施菌株DT-8的油菜田和未噴施的油菜田均可以捕捉到厲眼蕈蚊成蟲(chóng)，并且可以從這些成蟲(chóng)中檢測(cè)到SsHADV-1的DNA，在噴菌的油菜田檢出率高達(dá)81.4％，而在未噴施的油菜田檢出率為22.4％。表明攜帶S

13、sHADV-1的厲眼蕈蚊在田間自然存在，田間噴施菌株DT-8可以提高攜帶病毒的厲眼蕈蚊的比率。此外，從自然發(fā)病的油菜田采集厲眼蕈蚊成蟲(chóng)，通過(guò)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這些成蟲(chóng)攜帶多種真菌病毒，厲眼蕈蚊可能也可以傳播這些真菌病毒。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)真菌病毒（SsHDAV-1）可以跨界感染昆蟲(chóng)（厲眼蕈蚊），在其體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并且可以利用該昆蟲(chóng)作為介體在寄主真菌中傳播和擴(kuò)散。這是首次報(bào)道真菌病毒可以跨界侵染昆蟲(chóng)并在昆蟲(chóng)細(xì)胞中復(fù)制，同時(shí)證明厲眼