三種雙生病毒及其伴隨衛(wèi)星DNA的致病性研究.pdf

1、雙生病毒是一類世界范圍內廣泛發(fā)生的植物單鏈DNA病毒，已在多個國家和地區(qū)的作物上造成毀滅性災害。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，很多單組份雙生病毒伴隨有誘導典型癥狀所必需的衛(wèi)星DNAβ分子。這類衛(wèi)星DNAβ分子與其輔助病毒形成了一種新型的病害復合體，給亞洲和非洲地區(qū)的農作物生產(chǎn)造成了巨大損失。為了更好的了解雙生病毒的致病機理，本論文圍繞三種雙生病毒及其衛(wèi)星DNAβ的致病性進行了研究： l.與賽葵黃脈病毒相伴隨的衛(wèi)星DNAβ的分子變異及致病性研

2、究目前對雙生病毒伴隨的衛(wèi)星DNAβ的變異研究主要集中在來自不同寄主的衛(wèi)星DNAβ之間，本論文則對來自我國云南省不同地區(qū)賽葵上的20個與賽葵黃脈病毒(MYVV)相伴隨的衛(wèi)星DNAβ進行了克隆、測序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)這些衛(wèi)星DNAβ之間雖然變異較小，但是仍然具有按地理分布聚類的特征。侵染性測定表明衛(wèi)星DNAβ對于MYVV在本氏煙、心葉煙、矮牽牛和賽葵上引起典型的病害癥狀是必需的。進一步將MYVV與泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)DN

3、Aβ或中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)DNAβ共同接種本氏煙，發(fā)現(xiàn)MYVV可以支持異源雙生病毒的衛(wèi)星DNAβ在本氏煙中進行轉錄復制和系統(tǒng)移動，且病毒DNA在組織中的積累量與產(chǎn)生癥狀的嚴重程度呈正相關。 2.中國番茄曲葉病毒及其衛(wèi)星DNAβ的分子鑒定和致病性研究利用菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡并引物，對從廣西省采集的表現(xiàn)出葉片下卷等癥狀的番茄樣品(G16、G17和G18)進行了PCR檢測，經(jīng)過克隆、測序發(fā)現(xiàn)這些樣品均感染了雙生

4、病毒。對所得到的部分病毒基因組序列進行聯(lián)配比較后發(fā)現(xiàn)它們具有96.6％到98.5％的序列同源性，表明它們感染了同一個雙生病毒。因此對其中的G16和G18分離物進行了病毒全基因組序列測定，發(fā)現(xiàn)G16和G18的全長分別為2729個核苷酸(AJ704602)和2733個核苷酸(AJ558119)，它們之間的序列同源性達到987％。與其它已報道的雙生病毒進行比較發(fā)現(xiàn)，G16和G18與越南番茄曲葉病毒的相似性最高，分別為83.6％和82.8％。根

5、據(jù)雙生病毒“種”的分類標準，G16和G18代表同一個雙生病毒新種的不同分離物，因此我們將這個雙生病毒新種命名為中國番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV)。系統(tǒng)進化及重組分析發(fā)現(xiàn)ToLCCNV可能是一個由重組產(chǎn)生的新病毒。進一步通過PCR的方法發(fā)現(xiàn)這些分離物中都含有衛(wèi)星DNAβ，并對其全序列也進行了測定。序列測定表明與G16、G17和G18三個分離物伴隨的DNAβ的全長分別為1346個核苷

6、酸、1341個核苷酸和1342個核苷酸(AJ704610-AJ704612)。與其它已報道的衛(wèi)星DNAβ的序列比較發(fā)現(xiàn)這三個DNAβ分子都與中國番茄黃化曲葉病毒Y8分離物的DNAβ具有最高的同源性，分別達到49.1％、49.1％和49.8％。同時，為了研究衛(wèi)星DNAβ的致病性及生物學功能，構建了ToLCCNV-G18及其伴隨的衛(wèi)星DNAD的侵染性克隆，致病性測定發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星DNAβ是ToLCCNV誘導產(chǎn)生典型的病害癥狀所必需的，同時其還能提

7、高ToLCCNV在寄主植物中的積累量。 利用農桿菌共浸潤等方法發(fā)現(xiàn)ToLCCNV DNAβ編碼的βC1蛋白為RNA沉默抑制子。同時為了明確βC1蛋白中維持RNA沉默抑制子功能的關鍵氨基酸基序，根據(jù)生物信息學預測的結果構建了7個不同區(qū)段缺失的βC1突變體。農桿菌共浸潤試驗、Northern及Western印跡雜交結果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸構成的中心結構域(central domain)對于維持βC1抑制子活性是至關重要

8、的。 由于目前已報道的大多數(shù)RNA沉默抑制子也是致病因子，所以又構建了7個βC1不同區(qū)段缺失的DNAβ的突變體的侵染性克隆。侵染性測定發(fā)現(xiàn)所有的突變體都可以在ToLCCNV的輔助下系統(tǒng)侵染本氏煙，但是均不能誘導產(chǎn)生明顯的癥狀，表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其誘導產(chǎn)生典型病害癥狀所必需的。Southern印跡雜交分析發(fā)現(xiàn)雖然所有的突變體都能夠在本氏煙中復制并且各個突變體之間的復制水平以及對輔助病毒的影響不盡相同，但是總體來

9、說它們的復制水平遠遠低于野生型DNAβ的復制水平。以上實驗結果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其誘導產(chǎn)生病害癥狀的決定因素。 為了確定βC1蛋白及其突變體的亞細胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡對βC1及其突變體與GFP的融合蛋白在煙草表皮細胞中的亞細胞定位進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)不具備RNA沉默抑制子活性的突變體βC1 dm44-60和βC1 dm61-74也不能在細胞核中定位，而野生型及其它突變體βC1則均能在細胞核和細胞質

10、中定位，表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性與其能否在細胞核中定位有關，其44-74位氨基酸構成的中心結構域對于維持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在細胞核中的定位都是必需的。從ToLCCNV單獨接種或與其衛(wèi)星DNAβ共同接種的本氏煙中克隆到了11個病毒或衛(wèi)星DNAβ來源的小RNA。進一步的分析發(fā)現(xiàn)這些來源于病毒的小RNA主要集中在CP的轉錄區(qū)和βC1的轉錄區(qū)，表明病毒可能具有產(chǎn)生小RNA的熱點區(qū)。 3.泰國番茄黃化曲葉病毒是

11、一個伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)引起的番茄黃化曲葉病是影響泰國番茄生產(chǎn)最重要的病害之一，為了明確該病毒到底是單組份雙生病毒還是雙組份雙生病毒，構建了TYLCTHV-Y72分離物及其伴隨的衛(wèi)星DNAβ的侵染性克隆。致病性測定表明TYLCTHV可以單獨侵染本氏煙、心葉煙和番茄并誘導產(chǎn)生典型的癥狀，但是當與其衛(wèi)星DNAβ共同接種時則能夠加重病害癥狀，并且可以提高病毒在植物組織中的積累量。根據(jù)以上實驗

12、結果以及之前的相關報道，我們認為TYLCTHV是一個伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒。 4.廣西番茄曲葉病是由兩種雙生病毒及衛(wèi)星DNA復合侵染引起的通過PCR、Southern印跡、RCA-PCR以及測序等方法對采自廣西省表現(xiàn)出曲葉癥狀的31個番茄樣品進行了復合侵染檢測，發(fā)現(xiàn)雙生病毒的復合侵染是導致廣西省番茄曲葉病的重要原因。所有檢測的樣品中均含有ToLCCNV和中國番木瓜曲葉病毒(PaLCCNV)兩種病毒，同時還伴隨有ToL