阿托伐他汀對自發(fā)性高血壓大鼠細(xì)胞色素P450表氧化酶2C11和羥化酶4A1基因表達及血壓的影響.pdf

1、實驗背景 高血壓是嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病之一,它是許多疾病發(fā)病和致死的主要危險因素,如心、腦血管病和腎臟病等.因此,對高血壓病及其并發(fā)癥的防治具有重要的臨床意義.高血壓病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,當(dāng)二者作用累積到一定程度,最終導(dǎo)致基因表達異常及病理性血壓升高.然而對于絕大多數(shù)高血壓患者,其血壓升高的分子生物學(xué)機制仍不十分明確. 細(xì)胞色素P450基因超家族編碼形成的一群酶蛋白CYP450s(cytochrome

2、P450s)在藥物代謝等方面起重要作用,而花生四烯酸(arachidonic acid,AA)經(jīng)P450酶途徑的代謝產(chǎn)物對心血管系統(tǒng)的影響近年來日益受到重視.血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞、心肌及腎臟組織中富含細(xì)胞色素P450表氧化酶2C11(cytochromeP450 epoxygenase 2C11,CYP2C11)和羥化酶4A1(cytochrome P450 llydroaylase4A1,CYP4A1),它們代謝花生四烯酸分別產(chǎn)生四種

3、表氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)和20- 羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosal.tetraenoic acid,20-HETE),在調(diào)節(jié)血管張力和高血壓的發(fā)展中具有重要作用.EETs由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,是一種內(nèi)皮衍生性超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor,EDHF),主要是通過激活鈣離子敏感的鉀通道(Ca<'2

4、+>-sensitive potassium channel,Kca),使內(nèi)皮下的平滑肌細(xì)胞發(fā)生超級化反應(yīng)而產(chǎn)生擴血管效應(yīng);在體內(nèi)EETs主要轉(zhuǎn)化為二氫二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs),且后者同樣也具有舒張血管的效應(yīng):20-HETE由血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生,通過抑制Kca,使細(xì)胞去極化進而升高[Ca<,2+>i],導(dǎo)致平滑肌張力增加,具有收縮血管促進高血壓的作用. 他汀類藥物非調(diào)

5、脂作用機制的研究提示:阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)在血壓調(diào)節(jié)過程中起一定作用,因此,我們設(shè)想,其機制可能涉及CYP酶代謝途徑,有可能通過上調(diào)CYP2C11基因表達導(dǎo)致EETs增加;和/或下調(diào)CYP4A1基因表達導(dǎo)致20-HETE減少,從而改善血壓升高過程中血管收縮因子和血管舒張因子間的失衡狀態(tài),以利于保持血壓的平穩(wěn). 自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)長期

6、壓力超負(fù)荷對心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的作用在許多方面與人類高血壓病相似,對SHR血壓調(diào)節(jié)機制及其防治的研究,必將為人類高血壓調(diào)節(jié)機制及其臨床防治措施提供有意的實驗依據(jù). 實驗?zāi)康?本實驗以SHR為實驗?zāi)Ｐ?、阿托伐他汀為處理因?觀察不同劑量阿托伐他汀對SHR心臟、肝臟、腎臟及主動脈組織中CYP2C11和CYP4A1基因表達的影響,并檢測大鼠尿液中14,15-DHETs含量、計算LVWI、觀察腎臟形態(tài)學(xué)變化,以探討阿托伐他

7、汀影響血壓的可能機制. 實驗方法 選擇8周齡健康雄性SHR 18只,體重180-200 g以及同周齡和體重的雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠6只.SHR.隨機分為SHR對照組、阿托伐他汀50 mg組(HATV組,50 mg-kg<'-1>d<'-1>)和阿托伐他汀10 mg組(LATV組,10mg-kg<'-1>d<'-1>),每組6只.6只WKY為正常血壓對照組.阿托伐他汀充分研碎,用1 ml生理鹽水混勻,于

8、每日上午灌胃給藥,SHR對照組及WKY正常對照組每日同時用等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)給藥10周.分別于給藥前和給藥后每 2 周測量大鼠尾動脈收縮壓 (systolic blood pressure,SBP);給藥10周后,所有大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,抽取動脈血約2 ml,分別測定血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglycefide,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high densit

9、y lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(loW density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量;沿室間隔分離左心室(包括室間隔),計算左心室濕重與體重的比值即左心室重量指數(shù)(leftventricle weight index,LVWI);將大鼠的腎臟用10﹪的甲醛固定后,石蠟包埋,切片經(jīng)HE染色觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化;取心肌、肝臟、腎臟和主動脈組織放入液氮冷凍

10、后立即轉(zhuǎn)至-70℃冰箱保存,RT-PCR和 Western blot法分別檢測組織中CYP2C11 和 CYP4A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達;ELISA方法檢測尿液中14,15-DHETs含量. 采用SPSS 11.5 軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,統(tǒng)計指標(biāo)均進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,正態(tài)分布數(shù)據(jù)多組間比較采用One-WayANOVA分析.P<0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著性意義. 實驗結(jié)果 在

11、實驗觀察期間,我們發(fā)現(xiàn): (一) 予生理鹽水灌胃的 SHR 對照組與 WKY 正常對照組相比較: (1) 收縮壓水平在SHR對照組逐周上升,而WKY正常對照組無顯著性變化. (2) SHR 對照組大鼠LVWI與WKY正常對照組相比顯著增高. (3) 與WKY正常對照組大鼠相比,SHR對照組大鼠心肌、腎臟及主動脈組織中CYP2C11的mRNA與蛋白表達明顯上升. (4) 與WKY正常對照組大鼠相比,

12、SHR 對照組大鼠心肌、腎臟及主動脈組織中CYP4A1的mRNA 與蛋白表達明顯上升. (5) SHR 對照組大鼠尿液中14,15-DHETs含量顯著高于WKY正常對照組. (6) SHR對照組大鼠血脂的各項指標(biāo):TC、TG、LDL-C以及HDL-C的水平均明顯降低. (7) 與WKY正常對照組相比,SHR對照組大鼠腎小球囊腔擴大,毛細(xì)血管袢皺縮;腎小動脈管壁增厚,管腔狹窄. (二)同期給予阿托伐他汀灌胃

13、的HATV組和LATV組與上述2組相比較: (1)HATV組在給藥后第6、8和10周和LATV組在給藥后第10周收縮壓水平明顯低于同一時段SHR.對照組,但仍高于WKY正常對照組:HATV組在給藥后第8和10周收縮壓水平明顯低于同一時段LATV組. (2)HATV組LVWI明顯低于SHR對照組,但仍未能達到WKY正常對照組的程度;LATV組LVWI改善不明顯. (3) CYP2C11 mRNA的表達量在HATV組

14、的各組織中和LATV組的心肌中明顯高于SHR.對照組;CYP2C11蛋白的表達量在HATV組的各組織中和LATV組的心肌、腎臟和主動脈組織中明顯高于SHR對照組:用藥2組間CYP2C11的表達量在腎臟中有明顯差別. (4) CYP4A1 mRN.A的表達量在HATV組的心肌、腎臟、主動脈組織中和LATV組的腎臟、主動脈組織中明顯低于SHR對照組:CYP4A1蛋白的表達量在HATV組的腎臟、主動脈組織中和LATV組的腎臟中明顯低于

15、SHR對照組:而且用藥2組之間CYP4A1的表達量在腎臟中有明顯差別. (5) 與SHR對照組相比,僅HATV組大鼠尿液中14,15-DHETs含量顯著升高. (6)HATV組TC、TG及LDL-C水平明顯低于SHR對照組;而LATV組僅LDL-C水平明顯低于SHR對照組:SHR各組的HDL-C含量無明顯差異. (7) 與SHR對照組相比,HATV組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化有所改善,腎小球毛細(xì)血管袢輕度皺縮:腎小動脈內(nèi)

16、膜輕度增厚.而LATV組改善不明顯,腎小球毛細(xì)血管袢節(jié)段性皺縮:腎小動脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄仍較明顯. 實驗結(jié)論 (一)阿托伐他汀不僅能夠有效降低血脂水平,還能有效阻止SHR血壓的進一步升高;并在一定范圍內(nèi),大劑量阿托伐他汀對血壓的調(diào)節(jié)優(yōu)于小劑量阿托伐他汀. (二)阿托伐他汀可上調(diào)SHR心肌、腎臟和主動脈組織中CYP2C11基因的表達,并增加14,15-DHETs的生成;同時下調(diào)SHR腎臟和主動脈組織中CYP4A1