GDNF截短異構(gòu)體胞內(nèi)運(yùn)輸及分泌的機(jī)制研究.pdf

1、目的：膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活和分化的蛋白質(zhì)，研究表明GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用，因而引起了人們對(duì)其治療帕金森病的極大興趣。GDNF能促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)分化，使神經(jīng)元胞體增大、軸突延長(zhǎng)。GDNF還對(duì)損傷后的中腦多巴胺能神經(jīng)元有明顯作用。GDNF在大鼠腦中的表達(dá)主要見于中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的靶細(xì)胞，如紋狀體、伏核、丘腦核、嗅結(jié)節(jié)、海馬、小腦、扣帶回和嗅球的內(nèi)顆粒細(xì)胞，具有靶源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。GD

2、NF通過與其特異的受體結(jié)合，將其生物信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)：細(xì)胞膜外蛋白GFRs（GFRα1—GFRα4）與特異的GDNF家族成員結(jié)合后，才能激活作為公用受體的酪氨酸受體激酶Ret，從而發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。即GDNF作用于多巴胺能神經(jīng)元上的受體GFRα1或GFRα2，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，刺激早期基因編碼產(chǎn)生有生物活性的因子，起到穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+等其他離子的作用，從而阻止6—羥多巴胺引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。因此，

3、GDNF家族神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在體內(nèi)能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，這一點(diǎn)對(duì)于治療多巴胺代謝紊亂性疾病如帕金森氏病等方面，具有重要的臨床意義。 GDNF是一個(gè)含有二硫鍵的同源二聚體分泌性蛋白質(zhì)，其前蛋白含有18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列肽，首先合成的是含有211個(gè)氨基酸的前體蛋白稱為proGDNF，蛋白加工后的成熟蛋白含有134個(gè)成熟殘基，含有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)水解的同源性序列定位于exonⅡ。最近文獻(xiàn)報(bào)道GDNF前體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)

4、和分泌過程中起到了重要的作用。在特定的某些人群種及嚙齒類動(dòng)物中GDNF前體cDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的633bp的序列相比缺失了78個(gè)堿基（GDNF△78），這78個(gè)堿基的缺失并不產(chǎn)生框移突變，目前我們對(duì)GDN△78知之甚少，因此78個(gè)堿基的缺失是否影響人GDNF蛋白的分泌及其活性是本項(xiàng)研究的主要目的。不同的生長(zhǎng)因子，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族（NTs）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF—1）、膠質(zhì)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（GDNF）等在神經(jīng)細(xì)胞中通過結(jié)構(gòu)性分泌參與

5、神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、分化、神經(jīng)再生、突觸形成。GDNF△78對(duì)GDNF的加工、運(yùn)輸和分泌是否有影響并未明確，我們通過免疫熒光和Westrn blot的方法研究GDNF△78在神經(jīng)細(xì)胞中的定位及其分泌機(jī)制。 方法： 1．在PC12細(xì)胞中檢測(cè)GDNF△78和GDNF FL對(duì)分泌的影響：將GDNF△78和GDNF FL轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，利用Western blot的方法檢測(cè)他們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)，并且建立檢測(cè)細(xì)胞的組成型及調(diào)節(jié)型分

6、泌（高K+）的方法，研究二者在不同分泌途徑中的差異，采用ELISA進(jìn)一步證實(shí)Western blot的結(jié)果，檢測(cè)GDNF△78和GDNF FL在組成性分泌和調(diào)節(jié)性分泌中的不同。 2．GDNF△78和GDNF FL在神經(jīng)元中的運(yùn)輸：利用C—末端標(biāo)記HA標(biāo)簽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，用HA和神經(jīng)元樹突標(biāo)志物MAP2雙染觀察免疫熒光，判斷分泌情況。 3．確定GDNF△78異常的運(yùn)輸途徑：利用TGN38抗體共定位的方法，確定GDNF

7、△78在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)情況。 結(jié)果： 1．Western blot顯示GDNF△78和GDNF FL表達(dá)量相同而且均含有前體蛋白和成熟結(jié)構(gòu)。GDNF ELISA結(jié)果證實(shí)了GDNF△78在結(jié)構(gòu)性分泌和調(diào)節(jié)性分泌中與GDNF FL相比均有較明顯的降低。 2．免疫熒光顯示GDNF△78在PC12細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞中聚集在胞體部位的量高于GDNF FL。 3．免疫共定位顯示GDNF△78與GDNF F