桑樹LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特征及相關(guān)基因分析.pdf

1、轉(zhuǎn)座子（Transposon element，TE）是存在于生物基因組中的一段DNA序列，能夠從染色體上的一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)或者從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上。轉(zhuǎn)座子廣泛存在于原核和真核生物基因組中，是基因組的重要組成部分，在進(jìn)化中起著重要的作用。長(zhǎng)散在核元件（Long interspersed nuclear element，LINE），屬于RNA介導(dǎo)的Class I類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，兩端不含有長(zhǎng)末端重復(fù)序列，其對(duì)基因組的大小、

2、結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化等方面具有重要的作用。
　　桑樹是一種落葉性多年生木本植物，除被廣泛用于飼養(yǎng)家蠶外，還具有重要的經(jīng)濟(jì)、藥用和生態(tài)價(jià)值。隨著桑樹全基因組測(cè)序的完成以及桑樹轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫的建成，為研究桑樹LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子提供了平臺(tái)。目前，有關(guān)桑樹LINE的研究只停留在鑒定分類方面，具體的深入研究則無報(bào)道。本研究通過簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增桑樹LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase，RT）序列，對(duì)其特征進(jìn)行分析

3、，并從全基因組層面對(duì)桑樹LINE的結(jié)構(gòu)、插入基因區(qū)間偏好性和相關(guān)基因功能等方面進(jìn)行分析。最后篩選到由LINE的插入導(dǎo)致選擇性剪接發(fā)生的基因，對(duì)這些基因進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究桑樹LINE對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響提供候選基因。研究取得如下主要結(jié)果：
　　一、桑樹LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT片段的特征分析
　　1、使用簡(jiǎn)并引物從桑樹中分離、鑒定得到43條LINE RT序列，對(duì)這些序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LINE RT序列核苷酸長(zhǎng)度范圍在55

4、7-595 bp之間，富含AT堿基，AT/GC比例范圍為1.26-1.98，其序列間相似度范圍為31.8％-99.4%。這些結(jié)果表明桑樹LINE RT序列具有較高的異質(zhì)性。進(jìn)一步對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除MnoL_10之外，都存在終止密碼子，并且有93%（40/43）的序列發(fā)生了移碼突變，說明終止密碼子突變和移碼突變是導(dǎo)致桑樹LINE RT序列異質(zhì)性的主要原因。
　　2、43個(gè)桑樹LINE RT序列通過聚類可分為8個(gè)組，這個(gè)結(jié)

5、果與通過相似度分組是一致的，其中僅Group III和Group VIII兩組就占克隆總數(shù)的72%（31/43），推測(cè)這兩組為桑樹 LINEs的主要家族。終止密碼子分布及多序列比對(duì)結(jié)果顯示，同組中序列終止密碼子的分布模式相似，這表明同組 LINEs經(jīng)歷了相似的進(jìn)化模式，在相同或相近的時(shí)期經(jīng)擴(kuò)增而來。
　　3、43個(gè)桑樹LINE RT序列與13個(gè)植物物種同源的序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，顯示桑樹中的某些RT序列與外源植物的聚在一起，暗示LI

6、NE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子除發(fā)生垂直轉(zhuǎn)移外，在不同物種間還存在著水平轉(zhuǎn)移。
　　4、熒光原位雜交結(jié)果顯示，桑樹LINEs在染色體上呈散在分布模式，并不是隨機(jī)分布的，信號(hào)主要集中在近端粒區(qū)，少部分信號(hào)分布在近著絲粒區(qū)。
　　二、桑樹LINE的特征分析
　　1、從桑樹轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫下載LINE兩個(gè)超家族L1和RTE的36個(gè)全長(zhǎng)序列，分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中除包含一般LINE結(jié)構(gòu)中的EN、RT、RNaseH元件外，有些家族還包含CCHC鋅指結(jié)構(gòu)

7、和DUF4238，以及嵌套有LTR類型的GAG、RT和RNaseH等。
　　2、桑樹與其他植物物種同源的LINE RT和EN序列的多序列比對(duì)結(jié)果顯示，桑樹的LINE RT和EN序列與其他物種的同源性較高，都能夠找到相應(yīng)的保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，無論是基于RT還是EN構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，都是L1聚為一支，RTE聚為一支，這說明植物L(fēng)INEs超家族中的L1和RTE在分化后，便朝著不同的方向進(jìn)行進(jìn)化。
　　3、通過對(duì)桑

8、樹中LINEs插入基因不同區(qū)間的偏好性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LINE主要偏向于插入到基因內(nèi)部。對(duì)這些有LINE插入的基因進(jìn)行功能注釋和pathway分析，結(jié)果顯示這些基因主要參與到細(xì)胞組分中的cell（37.41%）、organelle（25.37%）和membrane（20.37%）；分子功能中的catalytic activity（48.35%）和binding（38.07%）；生物功能中的metabolic process（23.36%）

9、、cellular process（19.97%）和single-organism process（17.07%）。Pathway分析表明這些基因至少參與到81個(gè)生物途徑中，這些結(jié)果暗示著LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可能對(duì)參與到多個(gè)生物途徑中的這些基因具有潛在的調(diào)節(jié)功能。
　　三、桑樹LINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子選擇性剪接相關(guān)基因的分析
　　1、基于川?；蛭恢眯畔⒑蚅INE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位置信息，從桑樹基因組中篩選到560個(gè)有LINE插入的

10、基因（稱為L(zhǎng)INE相關(guān)基因）。進(jìn)一步結(jié)合選擇性剪接基因的位置信息，篩選出57個(gè)有LINE插入且發(fā)生選擇性剪接的基因，保留LINE插入到內(nèi)含子-外顯子，外顯子-內(nèi)含子，內(nèi)含子保留或跳過外顯子剪接區(qū)域的基因。這些由LINE的插入而形成的選擇性剪接基因被稱為L(zhǎng)INE選擇性剪接相關(guān)基因，共鑒定到10個(gè)。
　　2、對(duì)10個(gè)LINE選擇性剪接相關(guān)基因的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Morus009604、Morus023788和 Morus026596在

11、桑樹全基因組測(cè)序結(jié)果中因沒預(yù)測(cè)到蛋白類型，被定為假定蛋白。NCBI比對(duì)結(jié)果顯示它們分別與其他物種的多藥和毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MATE）家族ALF5（與白梨的相似度為74%）、節(jié)律鐘輸出基因（GIGANTEA）（與扁桃的相似度為84%）和酰基轉(zhuǎn)移酶（與梅的部分序列相似度為75%）具有較高的相似度。剩余的7個(gè)基因在桑樹中預(yù)測(cè)的和其他物種中比對(duì)到的結(jié)果是一致的，且都具有較高的相似度。
　　3、根據(jù)10個(gè)LINE選擇性剪接相關(guān)基因序列