家蠶微孢子蟲LTR反轉(zhuǎn)座子的活性研究.pdf

1、微孢子蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，能廣泛寄生于包括人在內(nèi)的所有動(dòng)物，目前已報(bào)道的微孢子蟲有150個(gè)屬，1400多個(gè)種。作為最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲——家蠶微孢子蟲，能感染經(jīng)濟(jì)昆蟲家蠶引發(fā)家蠶微粒子病，攻克微粒子病一直是蠶業(yè)界的重點(diǎn)和難點(diǎn)。然而對(duì)于家蠶微孢子蟲研究基礎(chǔ)的薄弱，成為了攻克這一難關(guān)的瓶頸。 轉(zhuǎn)座子是基因組中可以從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)位點(diǎn)并進(jìn)而影響到與之相關(guān)的基因功能的遺傳因子，它廣泛分布于真菌、植物、昆蟲、魚類和

2、哺乳動(dòng)物等，是基因組內(nèi)突變的主要原因之一。反轉(zhuǎn)座子是其中的一類，其在增殖和轉(zhuǎn)座時(shí)必須以RNA為中間產(chǎn)物，以DNA-RNA-DNA的方式進(jìn)行。目前已經(jīng)在許多物種中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)座子，但是微孢子蟲相關(guān)的報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)報(bào)道了8條完整的家蠶微孢子蟲LTR反轉(zhuǎn)座子—Nbr。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法、RT-PCR法等，對(duì)于家蠶微孢子蟲中是否存在具有活性的反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步開展家蠶微孢子蟲的進(jìn)化分析、基因功能的鑒定等奠定了基礎(chǔ)。

3、 1.蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定家蠶微孢子蟲的活性反轉(zhuǎn)座子 利用雙向電泳技術(shù)分離家蠶微孢子蟲總蛋白質(zhì)，切膠獲得71個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)譜分析鑒定出28個(gè)蛋白質(zhì)，其中有4個(gè)注釋為Pol蛋白。Pol是它的一個(gè)ORF，編碼多聚蛋白。繼已報(bào)道的8個(gè)Nbr，將它們分別命名為Nbr5(為已報(bào)道的)、Nbr9、Nor10、Nbr11。這4個(gè)Pol蛋自分布在基因組不同的scaffold上，氨基酸長(zhǎng)度分別為625aa、165aa、372aa、267aa，

4、分子量分別為34kD、19kD、49kD、31kD。通過在NCBI上BLASTP分析發(fā)現(xiàn)它們是反轉(zhuǎn)座子Pol ORF中的一段基因，編碼一種或幾種反轉(zhuǎn)座酶。 2.RT-PCK方法驗(yàn)證家蠶微孢子蟲反轉(zhuǎn)座子的活性 由于MALDI-TOF-MS的方法不能獲得氨基酸序列，有一定的局限性，本研究進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR對(duì)該4個(gè)Pol多聚蛋白在家蠶微孢子蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行研究。采用感染家蠶微孢子蟲第10天的家蠶中腸提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄

5、為sscDNA作為模板，結(jié)合Pol蛋白特異性引物做RT-PCR，擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶。通過RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得的4個(gè)Pol具有轉(zhuǎn)錄活性。 3.家蠶微孢子蟲EST庫中活性反轉(zhuǎn)座子的鑒定 從純化的家蠶微孢子蟲中提取總RNA，構(gòu)建EST數(shù)據(jù)庫。在其中檢索到了3條注釋為pol多聚蛋白的EST序列，分別命名為Nbr12、Nbr13、Nbr14。BLASTP注釋的期望值都在5.00E-72以上、同源性大于87

6、％，EST長(zhǎng)度大于300bp，檢索結(jié)果可信，表明這3個(gè)Pol多聚蛋白基因在家蠶微孢子蟲中具有轉(zhuǎn)錄本。 4.家蠶微孢子蟲活性反轉(zhuǎn)座子的生物信息學(xué)分析 將鑒定的7個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的Pol多聚蛋白兩端延伸4000bp，結(jié)合生物信息學(xué)的方法，找出完整的LTR反轉(zhuǎn)座子。對(duì)其進(jìn)行序列特征分析，發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲基因組內(nèi)LTR反轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)存在多樣性。LTR具有多態(tài)性，其長(zhǎng)度為26～306bp不等。ORF也存在不完整的情況，Nbr11的頭

7、部序列缺失，不存在Gag和Pro結(jié)構(gòu)域，RT結(jié)構(gòu)域也不完整：Nbr10的Pro結(jié)構(gòu)域缺失；Nbr9的RT結(jié)構(gòu)域也是不完整的；而Nbrl2的RT結(jié)構(gòu)域存在有1026bp的插入序列。雖然存在結(jié)構(gòu)上的不完整，但一些保守基序仍然是存在的：Nbr10和Nbr13具有Cys基序(CX2CX4HX4C)，而Nbr12則有一個(gè)類似前者的基序(CX2HX4HX4C)：Nbr12、Nbr13、Nbr14的Pro結(jié)構(gòu)域具有保守的D(T/S)G基序；而對(duì)于RT

8、結(jié)構(gòu)域，7個(gè)反轉(zhuǎn)座子都存在YXDD基序：在它們的RH結(jié)構(gòu)域中，除Nbr5和Nbr13具有的是類似DAS基序的DAC外，其他的反轉(zhuǎn)座子都存在該保守序列。 檢索發(fā)現(xiàn)7個(gè)LTR反轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)都很低(1～10)；-而且拷貝間具有比較大的異質(zhì)性(如Nbr14的Pi值為0.4280)，推測(cè)認(rèn)為這些反轉(zhuǎn)座子進(jìn)入家蠶微孢子蟲基因組的年代可能比較久遠(yuǎn)，而且存在著丟失現(xiàn)象。當(dāng)然，我們也發(fā)現(xiàn)除Nbr13外的其他家族都存在著同源性很高的拷貝(＞92％

9、)，認(rèn)為近期轉(zhuǎn)座事件仍在發(fā)生著，也從另一方面支持了它們是具有活性的。而Nbr13只有一個(gè)拷貝，可能就是由于序列變異程度太大，不能被檢索出來。 這些LTR反轉(zhuǎn)座子與已經(jīng)報(bào)道的8個(gè)Nbr相似，具有Ty3/gypsy群的特征(INT結(jié)構(gòu)域位于RT結(jié)構(gòu)域的3’端)，也通過系統(tǒng)進(jìn)化分析證明了這一分類，推測(cè)家蠶微孢子蟲基因組中的所有LTR反轉(zhuǎn)座子是來源于某一個(gè)Ty3/gypsy群的共同祖先。此外，進(jìn)化樹也將14個(gè)Nbr分成了兩枝，活性未知N

10、br的一枝與真菌Ty3反轉(zhuǎn)座子聚為一簇，而另一枝是本文鑒定有活性的，它們與實(shí)蠅Yoyo反轉(zhuǎn)座子聚在一起。 以前研究認(rèn)為Nbr對(duì)基因組的作用不大，它們多是與其他轉(zhuǎn)座元件成簇排列在一起，然后特異的插入共線性區(qū)域之間，不干擾基因組的正常排布。而我們除發(fā)現(xiàn)成簇聚集現(xiàn)象外(Nbr5)，還發(fā)現(xiàn)了插入共線性區(qū)域內(nèi)的Nbr11及其引起的基因組片段倒置現(xiàn)象，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它的Ka/Ks＞1，具有正向的進(jìn)化壓力，推測(cè)認(rèn)為它的轉(zhuǎn)座及引起的片段倒置適應(yīng)

11、了基因組的要求而被接受了下來。由此說明，家蠶微孢予蟲中的反轉(zhuǎn)座子對(duì)在基因組重排、進(jìn)化起到積極的作用。 結(jié)論：通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定、RT-PCR驗(yàn)證、EST庫搜索，在家蠶微孢子蟲中共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)具有活性的Pol多聚蛋白，利用生物信息學(xué)分析確定它們都是完整LTR反轉(zhuǎn)座子的一部分，從而推斷這些反轉(zhuǎn)座子也是具有活性的。然后對(duì)這些反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行相關(guān)生物信息分析，發(fā)現(xiàn)它們與之前已經(jīng)報(bào)道的Nbr屬于同一群體，拷貝數(shù)不高，各家族成員間卻有較大的異