HBV DNA載量、Toll樣受體3的表達(dá)變化與慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞表型、功能的相關(guān)性研究.pdf

1、慢性乙型病毒性肝炎(ChmnicHepatitisB，CHB)的發(fā)病機(jī)制一直是傳染病領(lǐng)域研究的重點、難點。至今，乙型肝炎病毒(HepatitisBⅥms，HBV)感染慢性化以及其持續(xù)感染的機(jī)制尚未闡明。在當(dāng)前慢性乙型肝炎治療缺乏有效措施的情形下，研究弄清HBV感染慢性化及持續(xù)感染的發(fā)生機(jī)制尤顯重要、緊迫。 很多研究認(rèn)為，HBV持續(xù)感染與體內(nèi)樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DCs)的功能下調(diào)密切相關(guān)，但對DCs功能下調(diào)的

2、發(fā)生機(jī)制尚無一致認(rèn)識。由于在CHB患者外周血中分離的DCs是在HBV感染后已經(jīng)呈現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài)中的細(xì)胞，我們認(rèn)為此時機(jī)體的免疫狀態(tài)應(yīng)以適應(yīng)性免疫(adaptiveimmune)為主，而HBV感染慢性化應(yīng)是天然免疫(innateimmune)和適應(yīng)性免疫共同作用的結(jié)果，因此，此時DCs的功能下調(diào)，可以解釋HBV持續(xù)感染時機(jī)體的免疫狀態(tài)，但這尚不能解釋HBV感染慢性化的過程。 本課題中，我們以DCs的成熟障礙(Dysmatumtio

3、n)的發(fā)生機(jī)制為研究目的，聯(lián)系天然免疫和適應(yīng)性免疫中與DCs的生物學(xué)功能密切相關(guān)的關(guān)鍵因素：患者外周血HBVDNA載量和DCs上表達(dá)的Toll樣受體(To1l-likereceptors，TLRs)，結(jié)合CHB的臨床特征，開展研究。 第一部分 不同HBVDNA載量的慢性乙型病毒性肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞的表型、功能變化 目的 研究觀察不同HBVDNA載量的慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞(Dendriti

4、cCells，DCs)表型、功能變化，探討HBV在DCs成熟障礙中的作用機(jī)制。 方法 篩選慢性乙型肝炎患者28例，入選時予PCR法測定外周血HBVDNA載量，經(jīng)肝穿刺明確肝組織病理狀念。入選病例符合HBVDNA載量>105copies／ml：除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾病兩個條件。入選后，所有病例予以核苷類似物抗病毒治療24周，再次測定外周血HBVDNA及肝穿刺。依據(jù)治療前后外周血HBVDNA載量分為兩組：高載量組(C

5、HB—H組)28例(HBVDNA>105copies/mD和低載量組(CHB．L組)25例(HBVDNA<104copies/mD。從患者外周血分離單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs。用流式細(xì)胞儀測定DCs表型；MTT法測定DCs對同種異體淋巴細(xì)胞的刺激增殖作用；EuSA法測定DCs分泌ILl2、ILl0等方法進(jìn)行研究。同時以10例健康人作對照。 結(jié)果 1.CHB．H組慢性乙型肝炎患者肝組織炎癥程度較CHB．L組為重，兩者有顯

6、著性差異(P<0．05)，但兩組間肝纖維化程度無顯著性差異，P>0．05。 2.DCs在體外經(jīng)細(xì)胞因子的刺激可明顯增殖，但慢性乙型肝炎患者DCs的擴(kuò)增數(shù)量、速度低于正常人(P<0．02)。 3.DCs表面標(biāo)記：正常人的HLA．DR、CD86(B7-1)、CD80(B7—2)和CD83表達(dá)陽性率均大于80％，而兩組cHB患者HLA-DR、CD86(B7-1)、CD80(B7-2)和CD83的表達(dá)率普遍降低，CHB．H組分別

7、為43．22±8.22％、37．89±7．75％、39．24±856％及2031±4．86％；CHB．L組分別為45．11±7．99％、4037±652％、3748±7．71％和22．87±5．68％。CHB患者DCs表面分子HLA-DR、CD86(B7-1)、cD80(B7．2)和CD83的表達(dá)較正常對照均顯著降低(P<0．001)，尤以CD83的降低更為顯著；不同HBVDNA載量的兩組CHB患者間則無顯著性差異(p>0．05)。

8、 4.兩組慢性乙型肝炎患者的DC在MLR中的刺激能力無顯著性差異(p>0．05)，但明顯低于正常對照組(p<0．01)。 5.CHB．H組DCs、CHB—L組DCs和正常人DCs上清液中IL一10的量分別為(19．74±8．34)pg/ml、(2136±4．88)pg/ml和(25．23±946)pg/ml，各組間差異無顯著性；在純DCs培養(yǎng)和MLR中，IL一12的量CHB-H組為(10237±48．96)pg/ml，CHB

9、．L組為(122．27±51．36)pg/ml則分別明顯低于正常人DCs(304．55±10152)pg/ml和(u6．27±55．54)pg/ml，有顯著性差異(P<0．005)。 結(jié)論 1.慢性乙型肝炎患者外周血HBVDNA載量與肝組織炎癥程度成正相關(guān)； 2.慢性乙型肝炎患者外周血DCs存在成熟障礙； 3.慢性乙型肝炎患者外周血DCs表型缺陷、刺激T細(xì)胞功能F調(diào)； 4.慢性乙型肝炎患者DCs的

10、表型變化、功能下調(diào)與外周血HBVD№載量間無顯著相關(guān)性。 第二部分 慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞上T01l樣受體3的表達(dá)變化研究 目的： 觀測分析慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞上Toll樣受體3(Toll-likereceptor3，TLR3)的表達(dá)變化，研究慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟障礙的原因，探討HBV感染慢性化與持續(xù)感染的機(jī)制。 方法： 篩選慢性乙型肝炎患者20例。入選時

11、予PCR法測定外周血HBVDNA載量。入選病例符合HBvDNA載量>105copies/ml；除外其他肝臟疾病及自身免疫性疾病兩個條件。入選后，予以核苷類似物抗病毒治療16周，再次測定外周血HBVDNA。依據(jù)治療前后外周血HBVDNA載量分為兩組：CHB—H組20例(HBVDNA>105copies／mD和CHB．L組17例(HBVDNA<104copies／mD。從患者外周血分離獲取單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs，對未成熟期DCs(im

12、matumtiveDCs，imDCs)與成熟期DC(matumtiveDCs，mDCs)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型測定；EuSA法測定DCs分泌ILl2等方法進(jìn)行研究；分別對imDCs與mDCs應(yīng)用流式細(xì)胞儀法和免疫印跡法(westemb10t)法測定TLR3的表達(dá)。同時以10例健康人作對照。 結(jié)果： 1.DCs在體外經(jīng)細(xì)胞因子的刺激可明顯增殖，但較含胎牛血清的完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式，其增殖速度較慢、數(shù)量較少(P＞0．05)；

13、 2.正常人組DCs于培養(yǎng)第5、7天CD80、CD86、HLA—DR、CD83的表達(dá)率分另0為：2831±8．79、8235±8．67；3L17±11．23、79．61±10．08；27．61±10．28、92．79±8．48：23．46±n．53、83．76±5．47，各組間比較均有顯著性差異，(P

14、．16±10．46、17．87±1038、14．28±6．77；而第7天的表達(dá)率分別為：4246±9．22、40．72±n．24、48．57±1251、22．25±n．22，各表面分子的表達(dá)率第5天和第7天兩組間的比較，均無統(tǒng)計學(xué)差異，P>O．05。CHB．L組DCs于培養(yǎng)第5、7天CD80、CD86、HLA．DR、CD83的表達(dá)率分另0為：20．13±10．43、39．48±7．63；19．16±645、34．58±13．44；22．

15、24±1237、43．73±16．87：1539±10．44、21．68±638，組間比較P>0．05。 3.正常人組、CHB．H組和CHB．L組imDC上TLR3的表達(dá)率分別為8．89±4．21、7．46±4．n、28．49±7．72，mDCs上TLR3的表達(dá)率分別為：正常人組5．71±4．33、CHB．H組6．68±3．17、CHB．L組6．15±3．88、。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果：正常人imDCs上TLR3的表達(dá)率明顯高于兩組CH

16、B患者，P0．05。正常人組imDCs上TLR3的表達(dá)率高于其mDCs，有顯著性差異，P0．05。 4.CHB患者DCs上TLR3的表達(dá)與其外周血HBVDNA載量無明顯相關(guān)性。CHB患者mDC上TLR3的表達(dá)與imDC無顯著性差異(p>O．05)。 5.三組DC

17、s的培養(yǎng)上清夜中ILl2的產(chǎn)量：正常對照組分別為：41．54±20．75、137．62±4338；CHB．H組分別為26．22±n．20、31．84±12．35；CHB．L組分別為3159±14．16、42．n±10．76，與正常對照相比較，兩組CHB的DCs產(chǎn)生ILl2的水平降低(P<0．05)。 結(jié)論： 1.通過細(xì)胞因子組合IL4、GM．CSF體外培養(yǎng)擴(kuò)增的DCs為imDC，經(jīng)TNF—a處理后的DCs為mDCs；