靶向Melittin溶酶體破膜與Tat介導(dǎo)的跨膜功能研究.pdf

1、本研究將利用抗體庫(kù)技術(shù)，體外篩選、克隆、表達(dá)去唾液酸糖蛋白受體的單鏈抗體，并對(duì)單鏈抗體的靶向性進(jìn)行分析，觀察重組scFv-Melittin肝臟的靶向能力以及破溶酶體膜功能，并探討重組Tat-TK融合蛋白的跨膜效應(yīng)，為進(jìn)一步構(gòu)建基因靶向運(yùn)輸及治療載體奠定基礎(chǔ)。 [目的] 從人源噬菌體抗體庫(kù)(TomlinsonⅠLibrary)中篩選與ASGPR特異性結(jié)合的單鏈抗體，研究其靶向肝細(xì)胞特異性；Melittin與該單鏈抗體融合蛋

2、白的破溶酶體膜功能；以及Tat介導(dǎo)HSV1-TK融合蛋白的跨膜效應(yīng)，為肝臟疾病的靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。 [方法] 1.去唾液酸糖蛋白受體H1亞單位CRD(CRDH1)的表達(dá)、純化與鑒定根據(jù)CRDH1的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以質(zhì)粒CRDH1/pET3為模板，PCR擴(kuò)增CRDH1基因并定向插入至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32c中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)重組融合蛋白CRDH1(rCRDH

3、1)；常規(guī)方法處理包涵體，Ni2+親和柱純化融合蛋白，在AKTAPrime液相色譜儀用HiTrapDesaltingcolumn進(jìn)行脫鹽，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)其濃度，采用BandLeader軟件分析其純度；并通過(guò)WB檢測(cè)其與兔抗人ASGPR血清的免疫反應(yīng)性。 2.抗rCRDH1單鏈抗體的篩選、表達(dá)與鑒定 以原核表達(dá)純化的rCRDH1作為篩選分子，從人源噬菌體抗體庫(kù)(TomlinsonⅠ)中篩選與去唾液酸糖蛋白受體H1亞單位C

4、RD區(qū)特異性結(jié)合的噬菌體，對(duì)人源化噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行四輪固相篩選，所獲得的陽(yáng)性克隆用表達(dá)純化的原核表達(dá)載體pET-32c中的親和標(biāo)簽(Trx-His-stag)進(jìn)行差異篩選，SDS-PAGE檢測(cè)可溶性表達(dá)，通過(guò)ABI3730全自動(dòng)熒光測(cè)序儀對(duì)獲得能分泌性表達(dá)特異性抗CRDH1單鏈抗體的噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序分析；制備陽(yáng)性克隆噬菌體并感染表達(dá)宿主菌HB2151，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體的表達(dá)，收集表達(dá)菌上清并用飽和硫酸銨沉淀上清中的單鏈抗體

5、，IMAC柱純化后，經(jīng)12％SDS-PAGE電泳、Western-blot及免疫組化方法分析檢測(cè)純化抗體的特性。 3.單鏈抗體-Melittin融合蛋白的構(gòu)建與效應(yīng)測(cè)定 人工合成編碼Melittin的兩條寡核苷酸單鏈(GenBank：X02007)，兩端分別引入NotⅠ和SacⅡ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，退火形成寡核苷酸雙鏈，30％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷退火效果；NcoⅠ和NotⅠ雙酶切含抗去唾液酸糖蛋白單鏈抗體C1基因的載體

6、C1/pIT2，低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收C1，采用分子克隆技術(shù)將其定向克隆至原核表達(dá)載體pGC中。將含C1M/pGC的XL1-Blue單菌落接種至LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用Ni2+螯合柱親和純化，免疫印跡技術(shù)(WB)分析重組蛋白C1M的抗原結(jié)合能力，溶血試驗(yàn)分析C1M的生物學(xué)活性。 4.Tat11-TK的融合表達(dá)與功能鑒定 合成編碼HIV-Tat47-57(Tat11)的兩條寡核苷酸單鏈(Gen

7、-BankNC001802)，兩端分別引入BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，退火形成寡核苷酸雙鏈，15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷退火效果；以r-pAs16Dr為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增HSV1-TK基因，采用分子克隆技術(shù)將其定向克隆至原核表達(dá)載體pET-32中。將含Tat11-TK/pET-32的BL21單菌落接種至LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用Ni2+螯合柱親和純化，免疫組化分析重組蛋白Tat11-TK的膜

8、結(jié)合能力，免疫印跡技術(shù)(WB)分析該融合蛋白的穿膜能力。 [結(jié)果]1.rCRDH1的制備及免疫原性 NcoⅠ和XhoⅠ酶切鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果表明，克隆基因的DNA序列與CRDH1的DNA序列完全一致，說(shuō)明構(gòu)建成功；含重組表達(dá)質(zhì)粒CRDH1/pET-32c的BL21菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出一約35.0kDa大小的融合蛋白；對(duì)表達(dá)菌液超聲后上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明，融合表達(dá)的rCRDH1以包涵體形式存在。Ni2

9、+親和純化后，獲得較純(純度大于95％)的rCRDH1重組融合蛋白，純化的重組融合蛋白能被兔抗ASGPR陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，而與抗ASGPR陰性對(duì)照血清呈陰性反應(yīng)。 2.單鏈抗體的特異性 經(jīng)第四輪篩選的產(chǎn)物，隨機(jī)取60個(gè)克隆經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，24株與rCRDH1重組抗原有較好結(jié)合活性，其中有14株與重組蛋白標(biāo)簽有交叉反應(yīng)，10株陽(yáng)性噬菌體與鼠不同組織提取的可溶性抗原，大腸桿菌抗原均無(wú)交叉反應(yīng)；10株陽(yáng)性噬菌體克隆

10、中有2株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)上清與rCRDH1抗原有較強(qiáng)的特異性結(jié)合活性，兩株陽(yáng)性噬菌體分別命名為C1、C2；經(jīng)PCR擴(kuò)增，C1和C2的擴(kuò)增片段長(zhǎng)約900bp，DNA序列分析證實(shí)基因全長(zhǎng)均為729bp，包括VH、VL和linker序列，VH處于linker的上游，VL處于linker的下游，均帶有3個(gè)互補(bǔ)決定簇，由(Gly4Ser)3組成linker，拼接完全正確。C1和C2為兩株不同的抗去唾液酸糖蛋白rCRDH1單鏈抗體。與人抗體胚

11、系基因數(shù)據(jù)庫(kù)相比較表明，重鏈V區(qū)屬于人免疫秋蛋白VH3家族，起源于免疫球蛋白胚系基因VHDP-47；輕鏈V區(qū)屬于VKI亞家族，起源于免疫球蛋白胚系基因DPK9，C1的GenBank登錄號(hào)：VH：AY789442；VL：AY789443。 3.單鏈抗體-Melittin融合蛋白的特性 成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒C1M/pGC，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)；在大腸桿菌XL1-Blue中有效表達(dá)出重組融合蛋白C1M；表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在；純化的

12、C1M大小為29.4kDa，濃度為0.6mg/ml；免疫組化結(jié)果說(shuō)明C1M能有效識(shí)別去唾液酸糖蛋白受體，紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)證明具有裂解紅細(xì)胞膜功能。 4.Tat介導(dǎo)HSV1-TK的跨膜功能 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE在60.7kDa左右顯示條帶，符合Tat11-TK與表達(dá)標(biāo)簽融合蛋白的理論值，并證明以包涵體的形式表達(dá)；通過(guò)Ni2+螯合柱親和純化獲得的Tat11-TK重組融合蛋白經(jīng)免疫組化證實(shí)能結(jié)合到肝癌細(xì)胞表面，免疫印跡結(jié)果

13、顯示Tat11-TK能有效穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)。 [結(jié)論]通過(guò)基因重組技術(shù)與蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)獲得具有抗原性的rCRDH1蛋白，以其作為篩選靶分子，通過(guò)與Trx-His-stag的差異篩選，從人源噬菌體抗體庫(kù)中篩選獲得兩株特異性抗rCRDH1的scFv，純化的單鏈抗體可與rCRDH1和肝癌組織以及正常肝組織特異性結(jié)合，表明所獲得的單鏈抗體具有功能活性與特異性，為進(jìn)一步研究其肝靶向特異性以及靶向基因治療奠定了基礎(chǔ)；該單鏈抗體