基于TNF-α跨膜段的跨膜真核表達載體的構建與初步鑒定.pdf

1、[目的]
　　 1.誘導HL-60細胞表達腫瘤壞死因子，RT-PCR擴增TNF-α全長片段。
　　 2.構建帶腸激酶酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α表達質粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和帶有FactorXa酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α表達質粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
　　 3.將已構建的pcDNA3.1-TM-enter

2、okinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表達質粒瞬時轉染3T3細胞。
　　 4.驗證融合蛋白表達情況。
　　 5.驗證酶消化細胞的細胞液中是否存在TNF-α。
　　 [方法]
　　 1.用佛波酯和脂多糖誘導HL-60細胞表達mTNF-α，反轉錄擴增TM-TNF-αcDNA。
　　 2.分別構建TM-TNF-α全長序列的克隆質粒pcDNA3.1-TM-TNF-

3、α、帶腸激酶酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質粒pcDNA3.1-TM-enterokinase、帶有FactorXa酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質粒pcDNA3.1-TM-FactorXa。通過重疊PCR將已替換了enterokinase酶切位點和FactorXa酶切位點的跨膜段與s-TNF-α DNA片段連接后，插入pcDNA3.1(+)質粒以構建pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3

4、.1-TM-FactorXa-TNF-α表達載體。
　　 3.將已構建的pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表達質粒瞬時轉染3T3細胞。
　　 4.通過RT-PCR鑒定mTNF-αmRNA的表達。
　　 5.Western blotting檢測細胞總蛋白中TNF-α和胞外消化液中TNF-α表達。
　　 [結果]
　　 1

5、.成功構建了TM-TNF-α全長序列的克隆質粒pcDNA3.1-TM-TNF-α。
　　 2.成功構建了帶腸激酶酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質pcDNA3.1-TM-enterokinase、帶有FactorXa酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質粒pcDNA3.1-TM-FactorXa、帶腸激酶酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α克隆質粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和帶有F

6、actorXa酶切位點的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α克隆質粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
　　 3.檢測了重組質粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α在3T3細胞中表達情況，兩種質粒均能表達融合蛋白。
　　 4.pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α質粒表達了跨膜的融合蛋白。
　　 [結論