犬穿通性顱腦火器傷模型的建立及繼發(fā)性腦損害機制的研究.pdf

1、論文一犬穿通性顱腦火器傷模型的建立及其生理、病理改變的觀察 目的： 對現(xiàn)有犬穿通性顱腦火器傷模型進行改進，延長動物的存活時間，觀察其生理、病理改變，為顱腦火器傷的病理、生理和分子生物學研究提供更加完善的平臺。 方法： 本地成年雄性雜種犬19只，體重20～25kg，隨機分為三組：A組按照傳統(tǒng)模型，直接致傷，n=5；B組為改進的模型，左側額顳頂部骨瓣開顱，骨窗大小約6.0×8.0cm，暴露腦組織后致傷，n=9

2、；C組為對照組，n=5，僅予開顱手術。致傷槍支為東風—SS03型小口徑速射手槍，初速190～210米/秒，彈丸質量2.60±0.05g。實驗前30min給予嗎啡10mg、阿托品0.5mg肌肉注射，實驗開始時給予硫賁妥鈉25mg/kg腹腔注射，氣管插管，以中間帶孔的木制牙墊固定于張口位，槍擊前靜脈給予氯胺酮40～50mg。犬仰臥，頭偏向右側、固定，頭下墊沙袋及厚木板，手槍固定于金屬支架上，距離犬頭20cm，激光指示器校準；入射點：A組為左

3、側額骨顴突后2.5～3.0cm，B組為左側額葉冠狀回中部，入射角度90°；射擊后受傷腦組織不做電凝止血，僅以明膠海綿、棉片保護創(chuàng)傷區(qū)?；萜?8354C型生理監(jiān)測儀連續(xù)記錄心率、血壓、呼吸變化，致傷后30min動脈采血做血氣分析，靜脈采血檢驗血糖及肝、腎功能。B組傷后6h，從四個區(qū)域取皮層腦組織，分別距傷道<0.5cm、0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、>4.0cm，C組同一時間按照對應部位取標本。一部分以甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、

4、切片、HE染色，光鏡下觀察；另一部分以戊二醛保存，鋨酸固定，Epon812包埋，超薄切片，電鏡觀察。統(tǒng)計學處理采用t檢驗及方差分析。 結果： B組傷后呼吸暫停時間和存活時間均大于A組(P<0.01)：A組MAP于傷后10min降至最低點，繼之以小幅度的升高，后期逐漸降低至正常值水平以下；B組傷后出現(xiàn)快速而短暫的明顯的血壓升高，繼而于傷后10min大幅度降低至波谷，后期逐漸回升至接近正常值水平；傷后兩組心率均立即下降，傷

5、后10min回升達峰值，之后再次緩慢下降，B組的變化幅度大于A組。傷后30min，A、B兩組致傷犬除血糖高于C組(p<0.05)之外，其他指標差異不顯著。光鏡下，腦組織可出現(xiàn)空泡化、網(wǎng)格化，神經(jīng)元胞體、胞核固縮、變形，胞質深染，可見核偏移；星形膠質細胞增大明顯，小膠質細胞增多；腦組織間散在小片狀出血，蛛網(wǎng)膜下腔出血，血管周圍間隙明顯增寬，部分血管破裂出血。電鏡下，神經(jīng)元胞核內異染色質凝聚、邊集，核膜模糊，胞質部分溶解，胞膜破損，粗面內質

6、網(wǎng)擴張、脫顆粒，線粒體嵴破壞、消失、甚至空泡化，核糖體減少，溶酶體增多：膠質細胞足突腫脹，胞膜破損，線粒體腫脹，嵴消失，呈空泡狀；有髓神經(jīng)纖維脫髓鞘多見，可見局部缺損、斷裂，軸索區(qū)形成空腔；血腦屏障內皮細胞胞膜模糊、局部破損，胞核內異染色質邊集，線粒體嵴缺失、空泡化，胞質內有較多的胞飲小泡，基膜大部分模糊，局部溶解。距離原發(fā)傷道越近，組織損害程度越重。 結論： 經(jīng)過改進的犬穿通性顱腦火器傷模型與現(xiàn)有的模型相比，動物傷后存

7、活時間明顯延長，彈著點更準確，傷道一致性更好，有利于進行更為深入的病理、生理和分子生物學研究。 論文二犬穿通性顱腦火器傷腦組織繼發(fā)損害機制的研究 目的： 探討TNF-α和NF—κ B/Rel家族成員在犬穿通性顱腦火器傷腦組織繼發(fā)損害機制中的作用，并比較它們在腦組織不同區(qū)域的表達差異，為更精確地劃分受損傷腦組織的病理分區(qū)提供依據(jù)。 方法： 本地成年雄性雜種犬14只，體重20～25kg，隨機分為兩組

8、：B組(n=9)為改進的模型，暴露腦組織后致傷；C組為對照組(n=5)，僅予開顱手術。B組于致傷后6h分別從三個區(qū)域取皮層腦組織，分別距傷道0.5～2.0cm、2.0～4.0 cm、>4.0cm，標志為B1組、B2組、B3組；C組于開顱手術后6h從皮層對應部位取材；一部分標本以10％甲醛溶液固定，24h后常規(guī)石蠟包埋、切片，采用免疫組化SABC法檢測，一抗為兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX—2、Caspase—3，每張切片選取5個高倍

9、視野，每高倍視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分比。另一部分標本液氮保存，分別行western blot及RT-PCR檢測。western blot采用兔抗大鼠TNF-α、兔抗山羊COX—2、兔抗山羊Caspase—3—抗，以β—actin為內參照，Bandleader軟件分析各電泳條帶與β—actin蛋白含量的比值，計算相對量。RT-PCR以gapdh為內參照，TNF-α(413bp)上游引物：5'CCC CAA GTG ACA A

10、GC CAG TA3’，下游引物：5' CAA AGT CCA GAT TAG GCA GAT3’；NF—κ B(P65)(490bp)上游引物：5' TAA TCG CCA TAG CCA TAG TCG3’，下游引物：5'GTT TTG CCT CCC AGT TCT GA3’；NF—κ B(P52)(381bp)上游引物：5'CCT ATC CAC GAC AAC CTT GC3’，下游引物：5' CAT AGA TGC TGC

11、TGA CCC AAC3’；COX—2(238bp)上游引物：5'ATC CCC TTC CTG CGA AAT AC3’，下游引物：5'GCA GAA GAA ACT TTT CCA CAA TC3’：Caspase—3(416bp)上游引物：5'ACC CGA AGG CTT GCA TAA GG3’，下游引物：5' ACC GAG GTG CCA TTC CAG TA3’；gapdh(419bp)：上游引物：5'TCC CGC C

12、AA CATCAAA3’，下游引物：5'TGA CCT TGC CCA CAG C3’。PCR反應產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察并攝像，用Bandleader軟件進行掃描分析，以目的基因條帶與gapdh條帶吸光度容積的比值作為目的基因mRNA的相對含量。以上數(shù)據(jù)應用SPSS10.0軟件，多組之間比較采用方差分析。 結果： TNF-α和COX—2的陽性染色部位為胞漿，致傷后在不同區(qū)域的腦組織的表達率

13、由B3至B2、B1逐步升高，差異顯著，它們與正常腦組織之間也存在顯著差異；Caspase—3在胞核、胞漿均有陽性染色，B2、B3以及C組之間的陽性表達率具有顯著差異。Western blot顯示：TNF-α、COX—2、Caspase—3蛋白在不同區(qū)域的腦組織的表達相對量均高于正常腦組織，其差異具有顯著性(p<0.05)；其中B1與B2組COX—2蛋白的表達相對量具有顯著差異(p<0.01)。RT-PCR顯示：TNF-α、P65、P52

14、、COX—2、Caspase—3的mRNA在不同區(qū)域的腦組織的表達相對量與正常腦組織之間均有顯著差異(p<0.01)；其中P65、COX—2的表達相對量由B3至B2、B1組逐步增高，具有統(tǒng)計學意義。 結論： (1)TNF-α參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害，但與損害的程度之間并不是簡單的線性關系；(2)RNA水平的檢測提示RelA(p65)和NF—κ B(p52)都參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害，但在因外源性刺激而激活的N

15、F—κ B蛋白中RelA(p65)可能比NF—κ B(p52)具有更大的比重，主要是由RelA(p65)介導了顱腦火器傷的繼發(fā)性腦損害。(3)通過免疫組化、western blot和RT-PCR的方法，觀察到COX—2和Caspase—3的水平在火器傷犬腦組織中的表達均顯著高于單純手術犬，提示它們都參與了犬腦火器傷后的繼發(fā)性損害，神經(jīng)細胞的變性和調亡是同時存在的。在不同創(chuàng)傷分區(qū)之間表達的差異顯示，因火器傷所致的神經(jīng)細胞減少，可能更多地歸

16、因于COX—2介導的神經(jīng)元變性；而Caspase—3在不同創(chuàng)傷分區(qū)之間的表達差異并不肯定，提示至少在腦火器傷的早期，神經(jīng)細胞的調亡并不是主要事件。 論文三實驗性犬顱腦火器傷的皮層腦電監(jiān)測 目的： 通過對動物模型犬的顱腦火器傷后皮層腦電監(jiān)測(ECoG)，初步探討顱腦火器傷與腦電特征的相關性。 方法： 本地成年雄性雜種犬9只，體重20～25kg，左側額顳頂部骨瓣開顱，骨窗大小約6.0×8.0cm，暴露

17、腦組織；應用Oxford Medelec數(shù)字腦電圖系統(tǒng)行ECoG監(jiān)測，采用銀針電極固定于額極、中央?yún)^(qū)、頂、枕區(qū)，另設頭皮參考電極2個，以參考導聯(lián)方式記錄，靈敏度50uV/5mm，高頻濾波30Hz，時間常數(shù)0.3S，走紙速度30mm/s，行ECoG監(jiān)測>30min后，以東風—SS03型小口徑速射手槍射擊冠狀回中部致傷并觀察生理、生化指標，傷后30min再行ECoG監(jiān)測，持續(xù)監(jiān)測時間>30min，分析損傷早期不同區(qū)域的ECoG變化情況。