白菜eIF(iso)4E基因?qū)uMV的抗性機(jī)制研究.pdf

1、大白菜（B.rapa L. ssp. pekiensis）起源于中國(guó)，是我國(guó)重要的蔬菜作物之一。病毒病是大白菜生產(chǎn)中的三大病害之一，嚴(yán)重影響了大白菜的生產(chǎn)。經(jīng)鑒定，蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus， TuMV)是侵染大白菜的主要病原。
　　本研究基于大白菜抗TuMV的隱性基因retr02（編碼eIF(iso)4E蛋白），開(kāi)發(fā)功能標(biāo)記，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，并通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)對(duì)TuMV株系與大白菜eIF(i

2、so)4E基因間互作關(guān)系及互作關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行分析研究，獲得以下研究結(jié)果：
　　1、經(jīng)過(guò)retr02和Retr02序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，retr02由于exon1/intron1連接處的Insert G造成錯(cuò)誤剪切，以致翻譯時(shí)提前終止，致使功能喪失。在該位點(diǎn)處開(kāi)發(fā)KASP_retr02和dCAPS-BslI標(biāo)記，對(duì)142株F2單株進(jìn)行篩選鑒定，鑒定結(jié)果與接種病毒后ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。將KASP_retr02和dCAPS-BslI標(biāo)記用于分

3、子標(biāo)記輔助育種，對(duì)118份自交系材料進(jìn)行篩選，選出抗病材料2份，感病材料116份。‘80186’為國(guó)家級(jí)抗病親本材料，但KASP_retr02和dCAPS-BslI標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果卻為感病。推測(cè)‘80186’材料不含有retr02抗病位點(diǎn)，應(yīng)該含有其他抗病基因或抗病機(jī)制。dCAPS-BslI標(biāo)記和KASP_retr02標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果一致，但dCAPS-BslI標(biāo)記操作復(fù)雜，而KASP_retr02便于生產(chǎn)上使用。
　　2、白菜作物中

4、eIF(iso)4E基因含有三個(gè)拷貝，分別為eIF(iso)4E.a、eIF(iso)4E.b和eIF(iso)4E.c，經(jīng)鑒定， eIF(iso)4E.b為假基因。通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)表明：pGBKT7:C4 VPg與pGADT7:eIF(iso)4E.a可以相互作用，而與pGADT7:eIF(iso)4E.c不能相互作用；pGBKT7:CDN1 VPg與eIF(iso)4E.c相互作用，而與pGADT7:eIF(iso)4E.a不能相

5、互作用。不同的TuMV株系與不同的eIF(iso)4E拷貝進(jìn)行互作。
　　3、通過(guò)對(duì)eIF(iso)4E蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，該蛋白包含有帽結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)，其中eIF(iso)4E.a與eIF(iso)4E.c之間存在20個(gè)差異氨基酸，其中17個(gè)差異氨基酸位于帽結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)上（占85％）。病毒侵染植株，在翻譯起始因子異構(gòu)體eIF(iso)4E與TuMV-VPg相互作用的過(guò)程中，eIF(iso)4E蛋白的帽結(jié)合結(jié)構(gòu)對(duì)于不同TuMV株系的侵

6、染起了關(guān)鍵作用。
　　4、TuMV-C4和TuMV-CDN1的VPg氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)部有5個(gè)差異氨基酸位點(diǎn)，即第52位I/L,第97位E/K,第101位N/D,第105位N/D和第117位I/V。利用重疊延伸PCR技術(shù)，以TuMV-C4 VPg質(zhì)粒為模板，定點(diǎn)突變獲得5個(gè)單突變體基因。并將這5個(gè)單突變體基因構(gòu)建酵母 pGBKT7載體。通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明：pGBKT7:C4 VPg與pGADT7:eIF(iso)4