母血漿中胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前診斷β-地中海貧血方法的研究.pdf

1、背景和目的:
　　常用遺傳性疾病產(chǎn)前診斷技術(shù)手段多為有創(chuàng)性操作,對孕婦及胎兒均有一定傷害,以致在臨床推廣及應(yīng)用中受到限制。而非侵入性的產(chǎn)前檢查方法如中孕期母血清HCG、AFP定量及超聲檢查的檢測范圍各有側(cè)重,僅能作為遺傳性疾病篩查的一種手段,不能作為診斷依據(jù)。近年來,隨著胎兒游離 DNA的研究不斷深入使無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法取得巨大進(jìn)展,利用孕婦血漿檢測胎兒性別、RhD基因已經(jīng)在國外的一些產(chǎn)前診斷中心開展;利用全基因組高通量測序及數(shù)字

2、PCR等方法檢測單基因疾病已有報(bào)道,目前仍處于研究階段,成本昂貴,而且操作十分復(fù)雜。
　　β-地中海貧血(簡稱β-地貧)是一種由β-珠蛋白基因突變導(dǎo)致β-珠蛋白鏈合成減少或嚴(yán)重缺乏所引起的常染色體隱性遺傳單基因疾病,是以β珠蛋白基因單核苷酸突變及小片段缺失為主要分子學(xué)基礎(chǔ)。以該疾病作為研究對象,構(gòu)建高特異性、高靈敏度、可用于低豐度基因單核苷酸突變及小片段缺失檢測的技術(shù),可為利用母體血漿中胎兒單基因遺傳性疾病的檢測尋求一種操作簡單、

3、成本低的新方法。
　　2004年Lo在Lancet報(bào)道應(yīng)用等位特異性熒光定量PCR技術(shù)檢測β地中海貧血小片段缺失突變CD41-42(del-CTTT)。但由于等位特異性PCR檢測低豐度突變時(shí)敏感度不高,目前仍未應(yīng)用于臨床。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)引物3￠末端人為引入耐核酸酶外切的硫代磷酸修飾的堿基時(shí),若引物3￠末端與模板不能完全匹配,具有3′→5′外切酶活性的高保真DNA聚合酶不能及時(shí)切除錯(cuò)配堿基,造成DNA聚合反應(yīng)的非成熟性終止,阻止引

4、物繼續(xù)延伸,有效地減少了PCR在檢測基因突變中常出現(xiàn)的假陽性結(jié)果。這一研究現(xiàn)已應(yīng)用于部分單基因遺傳性疾病臨床樣本的檢測,但目前未見應(yīng)用于低豐度基因突變的檢測。
　　在前期實(shí)驗(yàn)中,以β-地中海貧血常見的兩種單核苷酸突變位點(diǎn)為目標(biāo),利用常規(guī)PCR、LDR、毛細(xì)管電泳三者相結(jié)合的技術(shù)對所建立的地中海貧血胎兒母血漿 DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度為1:10000,因此證明該方法能夠滿足自孕婦血漿檢測胎兒父源性單核苷酸突變的要求。

5、但因在此實(shí)驗(yàn)中的PCR產(chǎn)物需要經(jīng)過純化,而后再將純化產(chǎn)物應(yīng)用于下一步LDR反應(yīng)中,在純化過程中極易污染,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　在本研究中,我們將高保真DNA聚合酶結(jié)合硫化修飾引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”與等位特異性實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合來檢測低豐度β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變,以期用于孕婦血漿中胎兒單基因疾病小片段缺失突變的檢測。而對于基因單核苷酸突變的檢測方法,我們將立足于前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上進(jìn)行簡化實(shí)驗(yàn)步驟等

6、改良,擬將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接應(yīng)用于LDR反應(yīng)后再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測,不再進(jìn)行純化等繁雜的操作步驟,以期達(dá)到減少污染、節(jié)約成本的目的。
　　材料和方法:
　　1.DNA聚合酶結(jié)合普通引物與高保真聚合酶結(jié)合硫化引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變基因片段全血基因組提取、引物退火溫度測試[模板為正?；蚪M DNA與CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因組DNA]、擴(kuò)增片段切膠回收后測

7、序。
　　2.高保真DNA聚合酶結(jié)合硫化引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”結(jié)合等位特異性實(shí)時(shí)定量PCR檢測β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)突變基因片段
　　將CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因組DNA稀釋成各濃度梯度進(jìn)行擴(kuò)增檢測,正?；蚪MDNA稀釋成各濃度梯度作為對照。
　　3.利用甲基化敏感限制性酶切法結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR檢測高甲基化RASSF1A片段以驗(yàn)證孕婦血漿DNA是否存在胎兒游離DNA。

8、　　采孕婦新鮮外周血5ml,制備血漿后提取孕婦血漿 DNA,限制性內(nèi)切酶 Hinp1I和Hha I進(jìn)行酶切后,實(shí)時(shí)定量PCR以RASSF1A為靶點(diǎn)檢測胎兒游離DNA。
　　4.普通PCR、LDR、毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合的改良方法檢測低豐度單核苷酸突變基因
　　4.1提取人類基因組全血DNA后送公司測序證實(shí)突變基因類型。將20pgCD17(A→T)突變雜合子、IVS-Ⅱ-654(C→T)雜合子突變型基因組DNA分別和1ng、10

9、ng、50ng、100ng的正?；蚪MDNA混合后建立β-地貧胎兒孕婦血漿模型,正常基因組DNA作為陰性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 LDR反應(yīng)后結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測連接產(chǎn)物。計(jì)算靈敏度。
　　4.2檢測正常孕婦血漿中的微量單核苷酸突變
　　正常孕婦血漿DNA中加入20pg單核苷酸突變雜合子外周血DNA后進(jìn)行擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及LDR檢測反應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1.無3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶結(jié)合普通引物進(jìn)行P

10、CR擴(kuò)增、電泳檢測產(chǎn)物后可見未明顯體現(xiàn)等位特異性PCR擴(kuò)增的溫度特異性;有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶結(jié)合硫化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測產(chǎn)物后可見PCR擴(kuò)增退火溫度越高,特異性越好,至67.8℃時(shí),可判讀正常基因與CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因。
　　2.將有3′→5′外切酶活性的高保真聚合酶與硫化引物構(gòu)成的“分子開關(guān)”結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測,在β地中海貧血CD41-42(del-CTTT)雜合突變基因

11、組DNA各濃度梯度中(分別為300ng、30ng、3ng、300pg、30pg)均可見明顯擴(kuò)增產(chǎn)物曲線;正?；蚪MDNA300ng擴(kuò)增產(chǎn)物可被檢出,其余各濃度梯度均未檢測出明顯擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　3.常規(guī)PCR、LDR反應(yīng)、毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合檢測基因點(diǎn)突變的靈敏度
　　用自動(dòng)測序分析儀檢測,該技術(shù)可檢測出以50ng正?；蚪MDNA中含有的20pgβ-地中海貧血雜合突變基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的LDR產(chǎn)物,且產(chǎn)物峰面積

12、與正常模板濃度成反比,檢測靈敏度最高為1:5000,陰性對照經(jīng)片段分析后未見LDR產(chǎn)物。
　　4.將酶切前后的孕婦血漿進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測,可見RASSF1A基因酶切前后可均被檢出,且酶切后Ct值較酶切前延后2.28;β-actin基因作為對照酶切前可被檢出,酶切后未被檢出。
　　5.正常孕婦血漿基因組 DNA中加入單核苷酸突變雜合子外周血 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的LDR檢測反應(yīng)結(jié)果,可見明顯連接產(chǎn)物峰。
　　結(jié)論: