纈沙坦高糖刺激下血管緊張素Ⅱ-Notch通路介導(dǎo)的系膜細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響.pdf

1、背景：
　　糖尿病(Diabetic mellitus，DM)是以血糖水平升高、伴有微血管和大血管并發(fā)癥為特征的一組代謝紊亂性疾病，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)作為DM最常見的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致DM相關(guān)終末期腎病的重要原因[1-3]，主要表現(xiàn)為進(jìn)展性白蛋白尿、腎小球?yàn)V過率下降、腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷等[4]。目前關(guān)于DN的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，遺傳因素、血流動力學(xué)改變、晚期糖基化終產(chǎn)物積聚、多

2、種細(xì)胞因子活化等均可能在DN的啟動和進(jìn)展過程中發(fā)揮一定作用。Notch基因由Morgan等在果蠅體內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)，其蛋白廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，Notch通路在DN進(jìn)展過程中明顯活化，并可介導(dǎo)腎小球及腎小管功能損傷，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化和新生血管生成[5-7]。炎癥、高糖刺激等條件誘導(dǎo)腎臟局部的腎素-血管緊張素Ⅱ系統(tǒng)（Renin-angiotensinⅡ system，RAS）活化，血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)作為

3、該系統(tǒng)重要的活性成分，激活后與AngⅡ受體1(AngⅡtype1 receptor, AT1)結(jié)合，可增加腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓力和血漿蛋白濾過率，進(jìn)一步加重尿蛋白的排出，在DN的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[8]。阻斷RAS因此成為DN防治的一個(gè)重要策略，目前此類藥物主要包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme，ACEI)和AngⅡ受體拮抗劑(AngⅡ receptor blocker,ARB)。研究發(fā)

4、現(xiàn)Notch通路可能部分介導(dǎo)AngⅡ引起的DN腎臟足細(xì)胞損傷過程，且ARB可通過抑制該通路發(fā)揮一定腎臟保護(hù)作用[9]。
　　目的：
　　1、觀察不同尿白蛋白（以尿白蛋白/尿肌酐即ACR表示）的2型糖尿病(Type2diabetes mellitus，T2DM)患者血清AngⅡ、Notch1濃度變化及臨床意義;
　　2、探討在高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(Rat mesangial cells，RMCs)外基質(zhì)分泌及纖維

5、化中Notch通路的作用以及ARB類藥物纈沙坦的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1、臨床研究部分:252例T2DM患者根據(jù)ACR分為正常白蛋白尿組(NA，ACR＜30mg/g)、微量白蛋白尿組(MA，ACR30-300mg/g)、大量白蛋白尿組(LA，ACR≥300mg/g)，90例我院體檢中心體檢結(jié)果正常者為正常對照組(NC)。ELISA法檢測血清AngⅡ、Notch1水平，并分析比較各組基本臨床資料、相關(guān)代謝指標(biāo)及ACR水平

6、。
　　2、實(shí)驗(yàn)研究部分:將傳代培養(yǎng)的RMCs同步化后分組:(1)正常糖對照組(NG，含5.5mmol/L葡萄糖);(2)高糖組(HG，含30.0mmol/L葡萄糖);(3)高滲對照組(HM，含5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇);(4)正常糖+DAPT（γ分泌素抑制劑，Notch信號通路抑制劑）組(NG+D，DAPT濃度為1μmol/L);(5)正常糖+纈沙坦組(NG+V，纈沙坦?jié)舛确謩e為1μmol/L、5μm

7、ol/L、10μmol/L);(6)高糖+DAPT組(HG+D，DAPT濃度為1μmol/L);(7)高糖+纈沙坦組(HG+V，纈沙坦?jié)舛确謩e為1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，培養(yǎng)12、24、48小時(shí)后收集細(xì)胞及上清液，WesternBlot法檢測Notch1蛋白表達(dá)情況，ELISA法檢測上清液細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor, TGF-β)、纖維連接蛋白(Fibron

8、ectin，F(xiàn)N)水平。
　　結(jié)果：
　　1、臨床研究部分
　　(1)ACR水平在各組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001）;
　　(2)AngⅡ在各組之間無明顯差異（P＞0.05）;
　　(3)與NC組相比，T2DM各組血清Notch1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，且隨著尿白蛋白水平增加，T2DM各組血清Notch1水平逐漸升高(P＜0.001);
　　(4)相關(guān)分析結(jié)果表明，

9、AngⅡ與Notch1之間呈顯著正相關(guān)(r=0.617,P＜0.001);
　　(5)多重線性回歸分析結(jié)果顯示Notch1、AngⅡ、糖尿病病程、血尿酸、收縮壓、糖化血紅蛋白對ACR有顯著影響，且Notch1對ACR的影響最大(t=20.726，P＜0.001)。
　　2、實(shí)驗(yàn)研究部分
　　(1)與NG組相比，高糖刺激RMCs12h左右可檢測到Notch1表達(dá)升高，峰值出現(xiàn)在24h(P＜0.05)，HM組與NG組相比差

10、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）;
　　(2)與NG組相比，高糖狀態(tài)下RMCs上清液中TGF-β、FN分泌量隨時(shí)間明顯升高(P＜0.05），HM組與NG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;
　　(3)高糖狀態(tài)下纈沙坦或DAPT預(yù)處理組與未處理組相比，培養(yǎng)24h左右，Notch1表達(dá)明顯減少(P＜0.05）;與未處理組相比，隨纈沙坦?jié)舛仍黾?，Notch1表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　(4)高糖狀

11、態(tài)下，與未處理組相比，纈沙坦或DAPT預(yù)處理組TGF-β、FN蛋白分泌量均明顯下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、血清Notch1可能作為早期DN診斷和預(yù)測白蛋白尿發(fā)生的新指標(biāo);
　　2、高糖可刺激培養(yǎng)的RMCs中Notch通路活化，上調(diào)下游TGF-β、FN分泌等，可能促進(jìn)RMCs纖維化過程;
　　3、DAPT可抑制Notch通路下調(diào)培養(yǎng)的RMCs上清液TGF-β、FN分泌，可能顯著改善高糖誘導(dǎo)的RMCs