條滸苔Rubisco聚集蛋白核影響因子研究及rbcL基因序列分析.pdf

1、本文主要用條滸苔(Enteromorphaclathrata)為材料，應用膠體金標免疫電鏡分子定位技術，研究了外界因子對光合作用第一個關鍵酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose1,5-Bisphosphatecarboxylase/oxygenase，E.C.4.1.1.39，簡稱Rubisco)在蛋白核和葉綠體基質之間遷移的影響，進而研究蛋白核在藻類CCM機制中重要作用。同時首次克隆了條滸苔Rubisco全長基因(rb

2、cL)和rbcL5’上游非翻譯區(qū)序列，為進一步研究Rubisco聚集蛋白核的分子機制奠定基礎。 首先應用生化分離純化技術，對條滸苔Rubisco進行了分離提取和純化，以制備Rubisco抗體，用于Rubisco金標免疫電鏡分子定位研究。通過硫酸銨分步沉淀、TSKDEAE650離子交換柱層析分離純化了條滸苔的Rubisco，并免疫注射兔子制備了Rubisco抗體。純化樣品經(jīng)過SDS-PAGE，Native-PAGE電泳和Weste

3、rn免疫印跡檢測鑒定，條滸苔Rubisco大小亞基分子量分別約為50kD和16kD，全酶的分子量在500kD左右。 以生長迅速、細胞具多個蛋白核的大型海藻條滸苔作為材料研究光照因素和CO2濃度對條滸苔Rubisco在蛋白核和葉綠體基質之間遷移的影響。應用金標免疫電鏡分子定位技術對Rubisco集中蛋白核程度進行數(shù)值化分析。電鏡下可觀察到標記Rubisco的金顆粒大部分集中分布在蛋白核中。根據(jù)Morita[1]提出的方法，設定PR

4、-ratio值(蛋白核內分布的Rubisco總量與蛋白核外類囊體基質中的Rubisco總量之比)作為衡量Rubisco集中蛋白核程度的分析指標。結果發(fā)現(xiàn)，在光強變化長期影響實驗中，當藻體轉入較高光強時，Rubisco明顯由葉綠體基質向蛋白核中聚集，從而更好地完成其光合作用功能。在完全黑暗處理和光合作用阻斷劑DCMU處理短期影響中，并未觀察到PR-ratio的明顯降低，但PR-ratio在24小時中的波動被提前，這可能是由正常生物節(jié)律的破

5、壞和藻類對不良環(huán)境的反應機制造成。此外，結果顯示條滸苔對光強變化的微小變化并不敏感。不同CO2濃度對于Rubisco分布的長期影響和短期影響研究均顯示CO2濃度升高時，Rubisco傾向于向葉綠體基質中擴散；CO2濃度較低或無CO2培養(yǎng)時，Rubisco不斷向蛋白核中集中。研究結果顯示，當光強較強或CO2濃度較低，藻類Rubisco可能通過集中蛋白核以活化來固定有限的CO2，保證光合作用正常進行。蛋白核可能在光合作用和CCM機制中具有重

6、要作用。 通過PCR特異性擴增葉綠體基因編碼的條滸苔大亞基編碼序列rbcL部分基因序列(1035bp)。依據(jù)基因步移原理，首次克隆得到條滸苔rbcL5’上游非翻譯區(qū)序列(224bp)。此外，依據(jù)3'-RACE(cDNA末端快速擴增技術)原理，克隆得到條滸苔rbcL3，末端cDNA序列(537bp)。根據(jù)3段序列，Rubisco大亞基全長基因序列和氨基酸序列可被推測得到。據(jù)推測，rbcL5’上游非翻譯區(qū)序列存在類似原核生物的啟動子