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文檔簡介
1、由花葉病毒引起的大豆花葉病毒病(soybeanmosaicvirus,SMV)是我國大豆生產(chǎn)中的嚴重病害。它可導致大規(guī)模的大豆減產(chǎn)。因此,迫切需要應用現(xiàn)代分子生物學的方法從整體水平上深入研究抗病機理,以尋找提高抗性的行之有效的方法。本文通過對抗病×感病雜交組合的后代分析,驗證了高抗SMV的大豆品系95-5383的抗性遺傳規(guī)律,利用cDNA-AFLP技術(shù)分析大豆花葉病毒病侵染后的基因表達情況,回收108條與抗病基因相關(guān)的差異片段,為后續(xù)工
2、作的進行打下基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下: 1.利用人工汁液摩擦法對6份大豆親本資源接種SMV3號株系進行抗性鑒定,不同品種接種后的癥狀類型不同,表明品種和株系間存在互作。 2.利用篩選出的高抗SMV3號株系的大豆品系95-5383與1個感病品種IA2020,配制雜交組合,對組合的F1、F2:3家系接種SMV3鑒定抗性。結(jié)果表明,中品95-5383與感病品種IA2020雜交組合的F1代表現(xiàn)為感病,F(xiàn)2:3家系的分離比例為1
3、:2:1,表明中品95-5383對SMV3號株系的抗性受一對隱性基因控制。 3.通過對浙江材料與美國抗病近等基因系及抗病品種的SSR分析,利用聚類結(jié)果表明親地理來源相同基因型相同的品種多數(shù)聚在一類。分聚在不同組間的大豆品種可能具有不同的抗病基因。由于美國近等基因系攜帶有不同抗病基因的材料聚在一類,以此為對照,表明擴增出的與對照相同條帶的抗性品種可能攜帶與對照相同的抗性基因,其它未擴增出的與對照相同條帶的抗性品種可能攜帶不同于對照
4、的抗性基因。 4.本實驗從接種后的10個時期,進行cDNA-AFLP技術(shù)分析大豆花葉病毒病侵染后的基因表達情況,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得到差異條帶比較豐富的0,4h,12h,24h,48h五個時期,故后續(xù)分析以此五個時期為主。 5.利用cDNA-AFLP技術(shù)分析大豆花葉病毒病侵染后的基因表達情況,最適合的引物組合為E-CGAM-CG和E-CTM-ATT,得到的差異條帶最多。其中2+2引物組合擴增帶數(shù)(93.0)大于3+2
5、引物組合擴增帶(91.9),后者大于2+3的引物組合的擴增帶數(shù)(59.3),2+3引物組合擴增帶數(shù)又大于3+3引物組合。即隨引物選擇堿基的增加擴增的譜帶數(shù)有降低的趨勢,這與理論上的概率是相一致的,因為每增加一個堿基將減少1/4的帶數(shù)。3+3引物組合譜帶數(shù)反而變少,因此,信息含量較少,不利于基因表達的鑒別。應以2+3或3+2引物組合較好。 6.基因差異顯示片段分析利用E1-6與M1-6的36對引物組合,對接種大豆花葉病毒后的0h、
6、4h、12h、24h、48h大豆葉片進行cDNA-AFLP分析,共擴增出個108個片段,各個時間處理與對照相比較,大部分帶型相同,每對引物平均擴增60~100條帶,片段大小為100~800bp。在36對引物中,20對引物擴增出了基因差異片段,其中16個引物可以擴增出穩(wěn)定的差異條帶,占引物組合的44%。這些引物對共擴增出108個差異表達的cDNA片段,其中87個(4h接種的有26個,占24%;12h接種的有28個,占26%;24h接種的有
7、16個,占15%,48h接種的有17個,占16%)是誘導性表達,占81%,21個是抑制性表達,占19%。引物組合中擴增效率較高的E2,可與引物M的5個引物擴增出差異條帶;其次為E1,可與不包括M4、M6的另外4個引物擴增出差異條帶,E3可與不包括M1、M2、M5的其他3個引物擴增出差異條帶;擴增效率較低的E4只與M1擴增出差異條帶,而E5、E6只與M4擴增出差異條帶。擴增效率最低的E5、E6只與M4擴增差異條帶。7.將從聚丙烯酰胺凝膠上
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