大豆對(duì)大豆花葉病毒抗性遺傳、抗性基因精細(xì)定位及表達(dá)分析.pdf

1、大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）病是世界大豆產(chǎn)區(qū)分布最廣的病毒病害之一，在我國(guó)各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量與品質(zhì)。培育和種植抗病品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑，而抗病育種的關(guān)鍵是具備優(yōu)異抗源，并闡明大豆對(duì)SMV的抗性遺傳規(guī)律。進(jìn)一步對(duì)抗性基因標(biāo)記定位、對(duì)分子標(biāo)記輔助選擇以及抗性基因克隆、明確抗性基因作用也有重要意義。
　　 因此，本研究針對(duì)新鑒定的部分SMV株系，篩選抗源、研究

2、抗性遺傳并精細(xì)定位抗性基因，為抗SMV育種提供抗性種質(zhì)和技術(shù)支撐。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time polymcrase chain reaction,QRT-PCR）技術(shù)對(duì)抗性基因目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的候選基因進(jìn)行定量表達(dá)分析研究，進(jìn)一步確定抗性品種抗病的關(guān)鍵基因，以闡明其抗病的分子機(jī)制，為大豆抗性基因的圖位克隆和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆的抗病性奠定基礎(chǔ)。同時(shí)采用分子標(biāo)記輔助選擇（Marker assisted

3、 selection,MAS）的方法，驗(yàn)證利用抗性相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)SMV抗性基因聚合的可行性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.抗源篩選
　　 為抗SMV育種篩選優(yōu)異抗源，本研究對(duì)新育成的參加2004-2007年國(guó)家及江蘇、北京和山東等省市大豆區(qū)試的品種在接種我國(guó)大豆產(chǎn)區(qū)主要流行SMV株系SC3和SC7的條件下分別進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：在抗SMV鑒定的334個(gè)品種中，對(duì)SC3抗性較好（高抗和抗?。┑钠贩N數(shù)有148個(gè)，占參試

4、品種數(shù)的44.31％;對(duì)SC7抗性較好的有71個(gè)，占參試品種數(shù)的21.26%;同時(shí)對(duì)兩個(gè)株系抗性表現(xiàn)較好的有55個(gè)，占參試品種數(shù)的16.47%。這些抗性較好的品種既可用于大豆生產(chǎn)，也可作為抗源用于抗病品種選育和與抗性相關(guān)的研究。研究還顯示，來自于西北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)的參試品種一般抗性較好。
　　 2.抗性遺傳爭(zhēng)抗性基因的等位性分析
　　 利用在我國(guó)長(zhǎng)江流域和北方大亙產(chǎn)區(qū)廣分布的SMV株系SC8對(duì)部分抗病品種與感病品種的雜

5、交后代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)F1均表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2分離結(jié)果經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)符合3抗：1感分離比例，F(xiàn)2：3家系符合1抗：2分離：1感的分離比例，結(jié)果表明：科豐1號(hào)、P196983、齊黃1號(hào)、大白麻、晉大74、汾豆56、中作229和NY58對(duì)SC8株系的抗性受1對(duì)顯性基因控制。齊黃22x南農(nóng)1138-2和其反交南農(nóng)1138-2x齊黃22的F1均表現(xiàn)抗病、F2表現(xiàn)為3抗：1感的分離比例，F(xiàn)2:3家系符合1抗：2分離：1感的分離比例，結(jié)果表明齊黃22對(duì)SC8

6、的抗性是由1對(duì)顯性基因控制，且抗性基因是由細(xì)胞核遺傳，無細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)?？箍菇M合的等位性測(cè)驗(yàn)顯示抗病品種晉大74×汾豆56的F1表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2和F2:3家系未發(fā)現(xiàn)感病株，表明晉大74與汾豆56攜帶對(duì)SC8株系的抗性基因是等位的或緊密連鎖的.研究還顯示齊黃1號(hào)與科豐1號(hào)、大白麻與汾豆56攜帶抗SC8的基因是不等位的，而且獨(dú)立遺傳。
　　 大白麻×南農(nóng)1138-2和南農(nóng)1138-2x大白麻的F1、F2和F2：3接種SC4株系的鑒定結(jié)果表

7、明，F(xiàn)1植株均表現(xiàn)抗??；經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，F(xiàn)2群體分離比例符合3抗：1感的比率；F2:3純合抗病家系、抗感分離家系和純合感病家系的比率符合1：2:1，表明大白麻對(duì)SC4的抗性是受細(xì)胞核遺傳的1對(duì)顯性基因控制，無細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。研究結(jié)果還顯示：冀LD42、科豐1號(hào)、徐豆1號(hào)、晉大74、PI96983、齊黃22、躍進(jìn)4號(hào)和汾豆56與感病品種雜交的F1均表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2均符合3抗：1感分離比例，F(xiàn)2：3家系符合1抗：2分離：1感的分離比例，證明它們對(duì)SC

8、4株系的抗性均各有1對(duì)基因控制，且抗病表現(xiàn)為顯性?？箍菇M合的等位性測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明大白麻與汾豆56、科豐1號(hào)、齊黃1號(hào)、早熟18四個(gè)品種攜帶抗SC4的基因是不等位的，冀LD42與汾豆56是不等位的，晉大74與中作229是不等位的，而且獨(dú)立遺傳。
　　 3.抗性基因的精細(xì)定位
　　 以抗病品種科豐1號(hào)和感病品種南農(nóng)1138-2為親本構(gòu)建的F2群體（156個(gè)F2單株），重組自交家系群體（184個(gè)家系）和次級(jí)F2群體（181個(gè)單株

9、）為材料，利用SNP和基因組SSR標(biāo)記將科豐1號(hào)對(duì)SC8株系的抗性基因RSC8精細(xì)定位在大豆的2號(hào)染色體上，RSC8兩側(cè)最近的基因組SSR標(biāo)記（BARCSOYSSR_02_0610和BARCSOYSSR_02_0616）之間的遺傳距離為0.32 cM，在大豆基因組上的物理距離不足200 kb。
　　 利用1047株大白麻×南農(nóng)1138-2的F2作圖群體，采用分離群體分組分析法，將對(duì)SC4株系表現(xiàn)抗病的大豆品種大白麻攜帶的抗性基因

10、天刪定位在大豆的14號(hào)染色體上，連鎖最緊密的基因組SSR標(biāo)記是BARCSOYSSR_14_1413和BARCSOYSSR_14_1416，與RSC4的遺傳距離分別為0.17 cM和0.27 cM，在大豆基因組上兩個(gè)標(biāo)記之間的物理距離不到110kb。
　　 4.抗性候選基因的QRT-PCR分析
　　 利用生物信息學(xué)的方法和QRT-PCR技術(shù)在抗性基因候選區(qū)段內(nèi)搜索候選基因并進(jìn)行分析：在RSC8抗性基因區(qū)段內(nèi)，14個(gè)預(yù)測(cè)基因

11、中有11個(gè)基因在SMV誘導(dǎo)后的表達(dá)量在抗感品種間存在程度差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)抗病候選基因的表達(dá)量在抗感品種間的響應(yīng)模式或時(shí)間上有很大的差異，推測(cè)這些基因可能參與了科豐1號(hào)對(duì)SC8株系的抗性反應(yīng)。在RSC4抗性基因所在的區(qū)段，初選的11個(gè)候選基因在抗感親本間的QRT-PCR分析表明，9個(gè)基因在接種SC4株系后的表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)抗感品種間都有響應(yīng)，深入比較發(fā)現(xiàn)7個(gè)候選基因在抗感品種間不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量有一定的差異，初步認(rèn)為這些基因可能

12、參與了大白麻對(duì)SC4株系的抗性反應(yīng)。通過上面的分析，推測(cè)候選基因Glyma02913310、13320、13400、13460、13470和Glyma14938510、38560、38580、39300可能是抗病關(guān)鍵基因。
　　 5.SMV抗性基因的聚合選擇
　　 針對(duì)SMV株系SC14、SC8和SC4，用齊黃1號(hào)（RSC14Q）、科豐1號(hào)（RSC8）和大白麻（RSC4）做抗性基因的供體，利用獲得的與各個(gè)抗性基因連鎖的9