人子宮內(nèi)膜的體外構(gòu)建及Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)ψ訉m內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜組織的影響.pdf

1、目的:宮腔粘連或纖維化是指因不規(guī)范宮腔操作、人工流產(chǎn)術(shù)、繼發(fā)感染等原因所造成的子宮腔部分或全部粘連而引起的一組癥候群。其發(fā)生率為20-30％。臨床上常出現(xiàn)月經(jīng)減少、閉經(jīng)和不育。這一不良結(jié)局主要體現(xiàn)在不孕不育的人群逐漸增加。即使采取手術(shù)治療，粘連再形成率高達50％。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，許多相關(guān)問題得到解決，但在輔助助孕妊娠失敗病例中有相當一部分由宮腔粘連或纖維化導致。
　　目前對于子宮粘連或纖維化的機制還不清楚，國內(nèi)外尚缺少有效

2、的診斷與防治手段。因此，急需相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究，闡明子宮內(nèi)膜粘連或纖維化的機制，從而研發(fā)新的診治技術(shù)，預防并進行有效治療。
　　本研究探討以人子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞作為種子細胞，以Ⅰ型液態(tài)鼠尾膠原和Matrigel膠為生物支架能否在體外按自然狀態(tài)的子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)構(gòu)建出具有三維立體結(jié)構(gòu)的組織工程化子宮內(nèi)膜，并且對其進行形態(tài)學與免疫組織化學分析;從而將為子宮內(nèi)膜的研究提供有益的實驗模型，并為最終構(gòu)建具有完整結(jié)構(gòu)的組織工程化子宮提供實

3、驗依據(jù)。在細胞、基因和蛋白水平，探討血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對人子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞數(shù)目和活性的影響，并且探討Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)υ隗w外構(gòu)建的人子宮內(nèi)膜組織的影響，為子宮內(nèi)膜粘連或纖維化的防治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、人子宮內(nèi)膜上皮細胞(EECs)和基質(zhì)細胞(ESCs)的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定
　　采用酶消化和離心法在體外分離、純化和培養(yǎng)

4、原代人子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞，用4％臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)和觀察細胞活力;采用光學顯微鏡、倒置顯微鏡和H&E染色觀察子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu);用免疫細胞化學方法鑒定子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞;用MTT法觀察雌二醇(E2)和孕酮(P4)對上皮細胞和基質(zhì)細胞增殖的影響。
　　2、體外子宮內(nèi)膜三維立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，培養(yǎng)及鑒定
　　制備Ⅰ型液態(tài)鼠尾膠原，以Ⅰ型液態(tài)鼠尾膠原和Matrigel為生物支架，將分離出的子宮

5、內(nèi)膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)傳代后作為種子細胞，接種在膠原中形成基質(zhì)細胞-膠原復合物，等其凝固后，再把Matrigel覆蓋在復合物上，把上皮細胞接種在Matrigel上，在體外按自然子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)構(gòu)建出具有三維立體結(jié)構(gòu)的組織工程化子宮內(nèi)膜，并且對其進行形態(tài)學與免疫組織化學分析。
　　3、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對人EECs增殖的影響
　　體外培養(yǎng)正常人EECs，采用MTT法觀察不同濃度(10-6 mol/L、10-7mol/L、10-8

6、 mol/L、10-9 mol/L) AngⅡ作用EECs24 h、48 h和72 h后對其增殖的影響。
　　4、血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]對AngⅡ誘導的EECs增殖的影響
　　觀察不同濃度(10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L) Ang-(1-7)和AngⅡ(10-6 mol/L)對EECs作用24 h、48 h和72 h后增殖的影響。
　　5、A

7、ng-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ淖訉m內(nèi)膜上皮細胞活性的影響
　　體外培養(yǎng)正常人EECs，將細胞分為對照組、AngⅡ(10-6 mol/L)組，Ang-(1-7)(10-5 mol/L)組和AngⅡ+Ang-(1-7)組。繼續(xù)培養(yǎng)細胞72 h后，用免疫細胞化學染色法檢測EECs中的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和上皮性鈣粘附素(E-cadherin)的表達水平;用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清液中細胞外基質(zhì)成分Ⅰ型膠原(Co

8、lⅠ)和纖粘連蛋白(FN)的含量;用western blot檢測EECs中α-SMA和E-cadherin的表達水平;Real time PCR檢測α-SMA mRNA、E-cadherin mRNA、FN mRNA和ColⅠ mRNA的表達水平。
　　6、AngⅡ?qū)SCs增殖的影響
　　體外培養(yǎng)正常人ESCs，采用MTT法觀察不同濃度(10-6 mol/L、10-7mol/L、10-8 mol/L、10-9 mol/L)

9、 AngⅡ作用子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞24 h、48 h和72 h后對其增殖的影響。
　　7、Ang-(1-7)對AngⅡ誘導的ESCs增殖的影響
　　觀察不同濃度(10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L) Ang-(1-7)和AngⅡ(10-6 mol/L)作用ESCs24 h、48 h和72 h后對其增殖的影響。
　　8、Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ腅SCs活性的影響

10、r>　　體外培養(yǎng)正常人ESCs，將細胞分為對照組、AngⅡ(10-6 mol/L)組，Ang-(1-7)(10-5 mol/L)組和AngⅡ+Ang-(1-7)組。繼續(xù)培養(yǎng)細胞72 h后，用免疫細胞化學染色法和western blot檢測ESCs活化標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的表達水平;用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清液中TGF-β1、IGF-Ⅰ、C

11、olⅠ和FN的含量;Rime Time PCR檢測ESCs中ColⅠmRNA、FNrnRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA和IGF-Ⅰ mRNA的表達水平。
　　9、Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ淖訉m內(nèi)膜組織活性的影響
　　在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜的三維立體結(jié)構(gòu)模型，將構(gòu)建的子宮內(nèi)膜分為四組:對照組、Ang-(1-7)組、AngⅡ組和Ang-(1-7)+AngⅡ組，用western blot檢測子宮內(nèi)膜的α-SM

12、A、TGF-β1和IGF-Ⅰ蛋白表達水平;Real Time PCR檢測子宮內(nèi)的α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA和IGF-Ⅰ mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1、子宮內(nèi)膜上皮細胞及基質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　用離心法獲得的的子宮內(nèi)膜上皮細胞在倒置顯微鏡下觀察呈團狀或葡萄串狀，其細胞純度＞90％。4％的臺盼藍溶液檢測細胞存活率達92％～96％，24 h后已貼壁生長，3天后細胞長成旋渦狀排列的致密單層

13、細胞集落，單個細胞形態(tài)呈類圓形或橢圓形，細胞核大而圓，一個，多位于細胞的中央，核仁明顯。用DMEM/F12和10％的胎牛血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細胞不能傳代。
　　H&E染色并在光學顯微鏡下觀察:上皮細胞形態(tài)呈類圓型或蝌蚪型，細胞核大而圓，一個，多位于細胞的中央，核仁明顯，染色質(zhì)疏松淺染;細胞質(zhì)相對較多，胞質(zhì)呈顆粒狀，嗜酸性。免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示:可見上皮細胞胞質(zhì)Cytokeratin染色陽性，呈棕黃色，細胞核為陰性，不顯色，而v

14、imentin染色陰性。
　　用離心法獲得的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞在倒置顯微鏡下觀察呈單個分散的細胞，其細胞純度＞92％。4％的臺盼藍溶液檢測細胞存活率達95％～98％，將分離的基質(zhì)細胞接種在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，2h已開始貼壁，12h已開始生長，細胞體向兩端突起，似出芽。細胞生長約3～4天即聚合成片。用DMEM/F12和10％的胎牛血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可以傳3～4代，培養(yǎng)早期的細胞光鏡下可見兩種形態(tài)，多數(shù)為梭形，另一種為多邊形或星形，細胞

15、核大呈橢圓形，一個，多位于細胞的中央，核仁明顯。
　　H&E染色并在光學顯微鏡下觀察:基質(zhì)細胞形態(tài)呈梭形、多邊形或星形，細胞核大呈橢圓形，一個，多位于細胞的中央，核仁明顯，染色質(zhì)疏松淺染;細胞質(zhì)相對較多，胞質(zhì)呈嗜酸性，染為粉紅色。
　　免疫細胞化學檢測:可見基質(zhì)細胞胞質(zhì)vimentin染色陽性，呈棕黃色，細胞核為陰性，不顯色，而Cytokeratin染色陰性。
　　MTT法觀察雌二醇(E2)和孕酮(P4)對上皮細胞和基

16、質(zhì)細胞增殖的影響:E2和P4單獨作用并不能顯著增加子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖(P＞0.05），但100nmol/L的E2和10nmol/L的P4對子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖作用顯著(P＜0.05），實驗的研究發(fā)現(xiàn)，當上皮細胞與少量基質(zhì)細胞混合培養(yǎng)在100nmol/L的E2和10nmol/L的P4的環(huán)境下時，上皮細胞能夠很好地傳至5～6代，而100nmol/L的P4對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的增殖作用顯著(P＜0.05）。
　　2、體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜三

17、維立體結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)及鑒定
　　構(gòu)建具有兩層結(jié)構(gòu)的組織工程化子宮內(nèi)膜在DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)第三天時，片層開始收縮，并隨時間的延長，收縮逐漸明顯。四根玻璃柱對片層起到靜態(tài)拉伸作用，同時還能防止過度收縮導致片層變厚。
　　組織工程化子宮內(nèi)膜經(jīng)H&E染色后顯示:對培養(yǎng)14天的組織工程化子宮內(nèi)膜取材，組織學研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過14天的培養(yǎng)，子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞狀態(tài)良好，上皮層細胞在液態(tài)膠原材料表面積聚生長，細胞近圓形，體積比基質(zhì)

18、細胞略大，細胞與細胞之間緊密相連，有些部位上皮呈扁平狀，但也有很多部位的上皮呈現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜所特有的極化柱狀形態(tài)，這為其發(fā)揮相應(yīng)的功能打下了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　組織工程化子宮內(nèi)膜免疫組化鑒定結(jié)果顯示:上皮層呈上皮角蛋白抗體(Cytokeratin)陽性，而基質(zhì)層中的基質(zhì)細胞呈Cytokeratin陰性?；|(zhì)層中的基質(zhì)細胞呈波形蛋白抗體(vimentin)陽性，而上皮層呈vimentin陰性。
　　3、AngⅡ?qū)ψ訉m內(nèi)膜上皮細胞增

19、殖的影響
　　子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后，紫色結(jié)晶通過測定550nm每個培養(yǎng)孔的吸光度值(A)觀察子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)目變化情況:AngⅡ可誘導子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05），且AngⅡ有呈劑量和時間依賴性地促進子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖作用;但24 h與對照組比較，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），48 h，72 h時，AngⅡ組細胞數(shù)目與對照組比較明顯增加（P＜0.05）。
　　4、Ang-(1

20、-7)對AngⅡ誘導的子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖的影響
　　子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后，紫色結(jié)晶通過測定550 nm每個培養(yǎng)孔的吸光度值(A)觀察子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)目變化情況:Ang-(1-7)組與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）;與對照組相比，AngⅡ組可誘導子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05）;而與AngⅡ組相比，AngⅡ+Ang-(1-7)組的子宮內(nèi)膜上皮細胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05）。

21、>　　5、Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ淖訉m內(nèi)膜上皮細胞活性的影響
　　細胞培養(yǎng)72 h后，免疫細胞化學染色法檢測結(jié)果表明:對照組細胞有少量α-SMA陽性表達，大量的E-cadherin的陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞α-SMA表達明顯增加而E-cadherin的表達明顯降低;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞α-SMA表達明顯降低而E-cadherin的表達明顯增加(P＜

22、0.05）。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測結(jié)果表明:與對照組比較，Ang-(1-7)組細胞上清液中FN和ColⅠ含量無明顯改變，AngⅡ組細胞上清液中FN和ColⅠ的含量明顯升高(P＜0.05）;與AngⅡ組比較，AngⅡ+ Ang-(1-7)組細胞上清液中FN和ColⅠ含量明顯減少（P＜0.05）。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，western blot檢測結(jié)果顯示:對照組細胞有少量α-SMA陽性表

23、達，大量的E-cadherin陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞α-SMA表達明顯增加(P＜0.05)，E-cadherin的表達明顯減少（P＜0.05）;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞α-SMA表達明顯減少(P＜0.05），E-cadherin的表達明顯增加(P＜0.05)。與免疫細胞化學染色法結(jié)果一致。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，Real time PCR檢測結(jié)果顯示:對照

24、組細胞有少量α-SMA mRNA、FN mRNA和ColⅠmRNA陽性表達，大量的E-cadherinmRNA陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞α-SMA mRNA、FN mRNA和ColⅠmRNA表達明顯增加(P＜0.05），E-cadherin mRNA的表達明顯減少(P＜0.05）;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞α-SMA mRNA、FN mRNA和ColⅠ mRNA表達明顯

25、減少（P＜0.05），E-cadherin mRNA的表達明顯增加(p＜0.05）。與免疫細胞化學染色法和western blot的檢測結(jié)果一致。
　　6、AngⅡ?qū)ψ訉m內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的影響
　　子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后，紫色結(jié)晶通過測定550nm處每個培養(yǎng)孔的吸光度值(A)觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)目變化情況:AngⅡ可誘導子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05），且AngⅡ有呈劑量依賴性地促進

26、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖作用;AngⅡ組細胞隨著培養(yǎng)時間延長，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖作用越明顯，但24 h與對照組比較，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），48 h，72 h時，AngⅡ組細胞數(shù)目與對照組比較明顯增加(P＜0.05)。
　　7、Ang-(1-7)對AngⅡ誘導的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖的影響
　　子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞培養(yǎng)24 h，48 h和72 h后，紫色結(jié)晶通過測定550 nm每個培養(yǎng)孔的吸光度值(A)觀察子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)目

27、變化情況:Ang-(1-7)組與對照組比較無明顯差異(P＞0.05）;與對照組相比，AngⅡ組可誘導子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05）;而與AngⅡ組相比，AngⅡ+Ang-(1-7)(10-5 mol/L)組的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05）。
　　8、Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ淖訉m內(nèi)膜基質(zhì)細胞活性的影響
　　細胞培養(yǎng)72 h后，免疫細胞化學染色法結(jié)果顯示:對照組細胞有少量α-SMA陽性表達，幾

28、乎無TGF-β1和IGF-Ⅰ陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞α-SMA、TGF-β1和IGF-Ⅰ表達明顯增加;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞α-SMA、TGF-β1和IGF-Ⅰ表達明顯減少(P＜0.05）。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，ELISA檢測結(jié)果顯示:與對照組比較，Ang-(1-7)組細胞上清液中TGF-β1、IGF-Ⅰ、ColⅠ和FN的含量無明顯改變，與AngⅡ組比較

29、，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞上清液中TGF-β1、IGF-Ⅰ、ColⅠ和FN含量明顯減少(P＜0.05）。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，western blot檢測結(jié)果顯示:對照組細胞有少量α-SMA陽性表達，幾乎無TGF-β1和IGF-Ⅰ陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞α-SMA、TGF-β1和IGF-Ⅰ表達明顯增加;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞α-SMA、TGF-

30、β1和IGF-Ⅰ表達明顯減少(P＜0.05），與免疫細胞化學染色法結(jié)果一致。
　　細胞培養(yǎng)72 h后，Real time PCR檢測結(jié)果顯示:對照組細胞有少量α-SMA mRNA陽性表達，幾乎無ColⅠ mRNA、FN mRNA、TGF-β1 mRNA和IGF-Ⅰ mRNA的陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組細胞ColⅠ mRNA、FN mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA和IGF-

31、ⅠmRNA表達明顯增加;與AngⅡ組相比，AngⅡ+Ang-(1-7)組細胞ColⅠmRNA、FN mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA和IGF-Ⅰ mRNA表達明顯減少(P＜0.05)，與免疫細胞化學染色法和western blot檢測結(jié)果一致。
　　9、Ang-(1-7)和AngⅡ?qū)Φ淖訉m內(nèi)膜活性的影響
　　子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)72 h后，western blot檢測結(jié)果顯示:對照組有少量α-SMA陽性表達

32、，幾乎無TGF-β1和IGF-Ⅰ陽性表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組α-SMA、TGF-β1和IGF-Ⅰ表達明顯增加;與AngⅡ組相比，AngⅡ+Ang-(1-7)組α-SMA、TGF-β1和IGF-Ⅰ表達明顯減少(P＜0.05）。
　　子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)72 h后，Real time PCR檢測結(jié)果顯示:對照組組織中有少量α-SMA mRNA陽性表達，幾乎無TGF-β1 mRNA和IGF-ⅠmRNA陽性

33、表達;Ang-(1-7)組與之類似;與對照組相比，AngⅡ組α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA和IGF-Ⅰ mRNA表達明顯增加;與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang-(1-7)組α-SMA mRNA、TGF-β1mRNA和IGF-Ⅰ mRNA表達明顯減少(P＜0.05)，與western blot檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1、成功地分離、培養(yǎng)及鑒定子宮內(nèi)膜上皮細胞及基質(zhì)細胞。
　　2、成功地在體外構(gòu)建子宮內(nèi)

34、膜三維立體結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)及鑒定。
　　3、在體外AngⅡ呈時間和劑量依賴地促進子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖。
　　4、AngⅡ可以促進子宮內(nèi)膜上皮細胞向肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化，表達肌成纖維細胞特異性蛋白α-SMA，而E-cadherin表達水平明顯下降;并改變其分泌功能，使ColⅠ和FN合成增加。
　　5、Ang-(1-7)能抑制AngⅡ誘導的子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖。Ang-(1-7)能抑制AngⅡ誘導的子宮內(nèi)膜上皮細胞向肌成纖維細

35、胞的表型轉(zhuǎn)化，抑制肌成纖維細胞特異性蛋白α-SMA的表達，而E-cadherin表達水平明顯增加;并改變其分泌功能，使ColⅠ和FN合成減少。
　　6、在體外AngⅡ呈時間和劑量依賴地促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞增殖。
　　7、AngⅡ可以促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞活化，表達肌成纖維細胞特異性蛋白α-SMA，并改變其分泌功能，使ColⅠ、FN、TGF-β1和IGF-Ⅰ合成增加。
　　8、Ang-(1-7)能抑制AngⅡ誘導的子宮內(nèi)膜